对从中国四川泡菜中分离的乳酸菌进行识别和鉴定

对从中国四川泡菜中分离的乳酸菌进行识别和鉴定

泡菜是传统的发酵蔬菜产品,在中国的四川省很受欢迎。本文研究的目的是通过分析来自四川省6个不同地区的36个样品来调查主要物质乳酸菌在泡菜中的多样性(实验室)。这些样品的实验室计数的记录是从3.90到8.40cfu ml-1。使用MRS琼脂培养基，从这些样本中获得总共有185个假定的革兰氏阳性实验室和过氧化氢酶缺乏的属性,这些菌株被发现在物种水平生理测试上，16 s rRNA基因测序和PCR扩增鉴定。结果显示,所有的所分离的乳酸菌都准确地确定为肠球菌thailandicus(2株)、乳杆菌(16株),l .短(24株),l . paracasei(9株),l .杆菌(81株),l . pentosus(38株),l . sakei(8株),l . spicheri(1株)、乳酸明串珠菌(1株)和片球菌属ethanolidu-rans(5株)。四川泡菜的主要实验室l .杆菌，它是从大多数样本中分离的。结果还表明,来自四川省不同地区的实验室物种复杂成分,和这样一个资源丰富的实验室菌株为进一步的研究提供原始数据涉及益生菌菌株的选择。

关键词：识别;乳酸菌;泡菜;16 s rRNA基因序列

介绍：

泡菜,一种有点咸有点酸的发酵的蔬菜,四川人已经吃了数百年。由于制作简单和独特的风味,泡菜很受欢迎，经常作为四川主菜的配菜或者开胃菜。自制的泡菜都是基于高度依赖于原材料生存的微生物存在而自然发酵,。对于所需酸度和风味水平的不同,泡菜的制备过程是很重要的。通常许多蔬菜,如白菜、芹菜、辣椒和萝卜都是沉浸在6 - 8%的盐溶液而红辣椒,葱和大蒜在一个特殊的罐子里夏天至少5 - 7天(约20-27°C)

冬天长达12 - 16天(约°C)8 - 15日。

采收的蔬菜表面上有各种各样的微生物，虽然蔬菜表面乳酸菌的数量(实验室)通常是相对比较低的，在最后的发酵阶段，由于实验室厌氧和低盐的条件使其快速增长 (Han et al., 2007)。刚采摘的蔬菜表面所附着的微生物主要是革兰氏阴性腐生菌(Seo et al., 2010)。在自然发酵过程的初始阶段，实验室的数量是低的，使得硝酸盐还原细菌快速增长(Yan et al., 2008)。在中间阶段,肠杆菌科(大肠杆菌、肠杆菌属等)和芽孢杆菌是低盐和厌氧条件下，他们逐渐死亡。同时,实验室菌种快速增殖,产生酸,在厌氧条件下成为优势种和抑制肠杆菌科和芽孢杆菌的生长。发酵结束时,大量的实验室将会控制微生物，使泡菜发酵保持稳定(Karasu et al., 2010; Panagou and Katsaboxakis, 2006)。因此，它是值得实验室从泡菜中进行分离菌体使泡菜能都进行工业化生产。

这项研究报告是对来自中国四川省不同地区的36个样品品种进行分离和鉴定。185个菌株通过表型特征进行初步鉴定，并且进一步通过16sRNA测序和PCR扩增技术进行测定。

材料和方法

泡菜样品的收集，36个样本的泡菜收集来自四川省的六个不同的地区，泡菜在抽样时的温度范围从8.7°C到16.4°C;平均温度为13.2°C(表1)，在采样现场泡菜汁的pH值测定应用校准便携式酸碱计(美国Extech pH100），室温下，泡菜汁的样品收集时间为15分钟,在冰上进行2 - 5 h运输和样品到达实验室后立即进行了微生物分析。

计数和隔离的实验室

稀释是1毫升的泡菜汁加9毫升生理盐水(0.9%氯化钠)。进一步连续稀释10倍，范围是10-5 到 10-9，在实验室进行处理和测定，使用布朗甲酚紫(BCP琼脂、Nissui制药、To-kyo、日本)厌氧30°C孵化 2天，平板在30°C用灭菌锅罐进行灭菌，(巴尔的摩生物实验室,GasPak 100厌氧系统,BD生物科学,火花,医学博士,美国)。菌落是从MRS培养基上随机地挑取，每个平板含有30-300个菌落，（Man Rogosa Sharpe 液体培养基，丙烯酰胺），并转移到5ml的MRS液体培养基中，选中平板上的菌落在MRS培养基上进行反复纯化，革兰氏阳性和过氧化氢阴性酶是从纯化的平板中提取，在-80°C，10%(w / v)脱脂牛奶进行冷冻储存。冻干

隔离进行长时间存储。实验室常规鉴别，进一步鉴定革兰氏阳性和过氧化氢阴性酶，是由使用以下物理方法进行分离:从精氨酸氨生产;二氧化碳是从倒杜伦管中的含有葡萄糖的MRS液体培养基中提取，

Table 1. General features of pickle samples from six different region of

Sichuan.

Sample Sampling Temperature

pH value LAB

Main material

number locatio

n (°C) (log cfu ml-1)

1 to 3 Chengdu

15.9±0.5 3.8±0.3 5.54±1.49

summer radish (15.5‒16.4) (3.5‒4.0) (4.15‒7.11)

4 to 7 Chongzhou

13.1±0.5 3.4±0.2 6.95±0.71

celery, cowpea, cabbage, bamboo shoots (12.6‒13.5) (3.2‒3.5) (5.99‒7.69)

8 to 19 Dayi 12.3±1.7 3.7±0.4 6.65±1.34

summer radish, celery, cowpea, cabbage,

Chinese

(8.7‒15.1) (3.5‒4.5) (3.90‒8.17) cabbage

20 to 25 Pujiang

14.5±1.5 3.8±0.6 6.82±1.51

summer radish, celery, cowpea, cabbage,

bamboo

(11.5‒15.3) (3.2‒4.5) (4.89‒8.26) shoots

26 to 34 Qionglai

13.2±1.3 3.5±0.4 6.26±1.09

summer radish, celery, cowpea, Chinese

cabbage,

(11.9‒15.3) (3.0‒4.2) (4.36‒7.54) carrot

35 to 36 Xinjin

11.6±0.8 3.7±0.9 7.73±0.95

summer radish, cowpea, celery, cabbage,

capsicum

(11.0‒12.2) (3.0‒4.3) (7.05‒8.40) frutescens

Average 13.2±1.7 3.6±0.4 6.58±1.25

分别在10°C,15°C,45°C和50°C的情况下在MRS液体培养基中生长5天，在pH值为

3.0,3.5,

4.0,4.5,

5.0,9.0和9.6的情况下在MRS液体培养基中生长3天，MRS培养基中的耐盐度为含有2.0% 3.0%,4.0%,

6.0%,6.5%,8.0%和10.0%氯化钠(w / v)，在分离菌种的温度下培养3天(Ko-zaki et al .,1992;Yu et al .,2011)。用一套商业工具通过D和L乳酸产生葡萄糖同分异构体的类型和数量来改变MRS培养基。(霍夫曼罗氏诊断,Mann-heim,德国)。