药品的微生物学检查ppt

※方
1.平板划线接种法
（1）平行划线法 （2）分区划线法
法
2.琼脂斜面的接种方法 3.液体培养基接种法 4.半固体接种法
分区划线法
菌落
斜面移种技术
菌苔
液体移种技术
穿刺技术
药物的微生物限度检查方法（二）
取出前次实验培养物观察： 1.口服药物 1)细菌鉴定： 在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长： 增菌液变混浊―――――有 -----接种在伊红美兰琼脂平板培养基 上面。 方法：分区划线接种。 2)细菌总数测定： 选择30-300个菌落平板， 细菌总数＝菌落数×稀释倍数
※培养基的制备程序
※ 调配→矫正pH（7.0-7.6）→分装→ 灭菌（121.3℃，
20-30分钟）→放入冰箱冷藏备用。 • 因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比 所需的pH高。 • 鉴定是否有菌可将培养基置于37 ℃培养24小时，然
后观察。
二、细菌的接种技术
材 料
• 普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体斜面培养基 大肠埃希菌培养物（１套／台）
各加9ml生理盐水
1ml 1ml
从剩余10ml悬液中取1ml 加入上述四个稀释管中
10-1
10-2 10-3
10-4
从上述四个稀释管中各取1ml混入溶化的琼脂培养基中，
混匀，冷却后置37℃恒温培养箱培养24小时 。
实验二 药品的微生物限度检查（二） 细菌的形态学检查及培养接种技术
一、目的要求: 1、了解细菌培养接种技术 2、掌握细菌基本形态 3、掌握药品的微生物学检验程序和方法 二、实验内容 1.药物的微生物限度检查（二） 2.空气、皮肤细菌检查结果测定。 3.讲授基础培养基的制备方法（营养琼脂、营养肉汤）。 4.细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法(基本技能) 液体培养基 平板培养基 斜面培养基 双糖含铁半固体斜面培养基 5.显微镜下观察 细菌的基本形态: 球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。 特殊结构： 肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。 6.培养基的种类和用途 普通培养基、营养培养基、厌氧培养基、选择培养基
药品的微生物限度检查实验目的 通过实验了解药品微生物限定检查法的
意义、设wk.baidu.com方法、细菌检查常用的基本技术
和程序，结果分析方法。
药品的微生物限度检查实验程序
一、药品的预处理 二、药品的增菌培养、结果分析 三、细菌分离鉴定、结果分析
药品的微生物限度检查实验方法（一）
1.药品的预处理 口服药 外用药
2克药品加20毫升生理盐水， 研磨制成悬液
实验一 药品的微生物限度检查（一） 实验室常用消毒灭菌设备 空气和皮肤细菌检查方法（综合实验+基础实验）
一、目的要求 1、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备 2、了解空气、皮肤细菌检查方法 3、掌握药品的微生物学检验程序和方法 二、实验内容 1.药品的微生物限度检查（一） 1）口服药物的检查: ①药品的预处理： ②大肠杆菌的检查： ③细菌总数的检查： 2）外用药物的检查: ①药品的预处理： ②绿脓杆菌的检查： ③金黄色葡萄球菌的检查： 2.空气、皮肤细菌检查方法(验证) 3.微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备： 高压蒸汽灭菌锅、消毒煮沸器、G6玻璃滤菌器装置、洁净工作台、 移动式 紫外光灯、鼓风式干烤箱、紫外线杀菌标本。
病毒的分离培养—鸡胚接种
病毒的分离培养—鸡胚培养
病毒名称
痘类病毒 流感、副流感、腮腺 炎病毒
接种部位
绒毛尿囊膜 尿囊
鸡胚胚龄（天）
10～13 9 ～11
嗜神经病毒
初次分离标本
卵黄囊
羊膜腔
5～8
10～12
实验五 药物的微生物限度检查（五）
一、目的要求 掌握药品的微生物学检验程序和方法 二、实验内容 以生化反应（IMViC）检测口服药中细菌的性质。
细菌基本形态
球菌
杆菌 螺形菌
葡萄球菌
链球菌
大肠埃希菌
枯草杆菌
霍乱弧菌
细菌特殊结构
鞭毛 荚膜
芽孢
spore
破伤风梭菌
实验三 药品的微生物限度检查（三） 微生物的形态学检查及药物的敏感性试验
一、目的要求: 1、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法 二、实验内容
--------------------------------------试验结果 -----------试验 加试剂 培养基
大肠埃希菌 吲哚(I) 甲基红(M) 产气杆菌 无色变 阴性（-） 黄色 阴性（-）
蛋白胨水2管 葡萄糖蛋白胨 水2管
苯甲醛试剂 0.5ml(5滴) 甲基红5滴
培氏乙6滴—— 萘酚试剂6滴
实验四 药物的微生物限度检查（四） 病毒和细菌及其他病原微生物
一、目的要求 1、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法 二、实验内容 1、药物的药物的微生物限度检查（四） 1）将口服药物中的细菌分别接种：①蛋白胨水培养基； ②葡萄糖蛋白胨水培养基； ③枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。 同时接种产气杆菌于上述培养管做对照，以备进行IMViC试验。 2）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物中细菌进行血浆凝固酶检测,依 据 其反应结果,确定该菌的性质及名称。 2 、抗酸染色 3 、真菌培养物的观察------黑曲霉、木霉 、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌丝， 酵母菌菌落的观察。 4 、记录中草药、抗生素抑菌试验结果 5 、观察鸡胚的结构
※一、空气、皮肤细菌培养现象观察
（一）记录空气微生物培养结果 • 菌落数目、大小、边缘、颜色、粗糙（光滑）
（二）记录皮肤微生物培养结果 比较消毒前后细菌菌落数，菌落特点。
※培养基的制备
培养基分类
根据物理性状分类： 液体培养基 半固体培养基 固体培养基 根据用途分类： 基础培养基 营养培养基 选择培养基 鉴别培养基 厌氧培养基 主要用于增菌 用于检测动力及保存菌种 用于分离鉴定细菌 普通琼脂培养基 血液琼脂培养基 SS培养基 双糖铁培养基 庖肉培养基
2）抗生素---青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。
药物的微生物限度检查（三）
1）从伊红美兰琼脂平板培养基上----挑取黑色带有金属光泽的湿润菌落，接种在普通琼脂斜 面培养基上面，进行细菌的纯培养。 2）观察外用药物在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上生 长状况。 记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠 度等。 革兰氏染色镜下观察其菌落形态。 根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该 被检菌的名称。 3）从卵黄高盐琼脂平板培养基上生长，挑取黄色的湿润菌 落，接种在普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的纯培养。
--------------------------------------试验结果 -----------试验 加试剂 培养基
大肠埃希菌 产气杆菌 1
蛋白胨水2管 葡萄糖蛋白胨 水2管
1
1
1
葡萄糖蛋白胨 水2管
枸橼酸盐2管
1
1
1
1
实验四 药物的微生物限度检查（四） 病毒和细菌及其他病原微生物
取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物中细菌进行血浆凝固酶检测,依 据 其反应结果,确定该菌的性质及名称。
2.细菌的生长现象及代谢产物的观察
菌膜
对照
混浊生长
菌沉淀
均匀浑浊
菌膜生长
3.中草药、抗生素抑菌试验
纸片法
• 原理：革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁差异 • 应用 • 方法 标本片制备 革兰染色 • 结果
六、革兰染色法
2.革兰染色 （1）初染：滴加结晶紫染液l～2滴，1分钟.水洗 （2）媒染：滴加碘液， l～2滴，作用1分钟后水洗。 （3）脱色：滴加95％酒精数滴，（约15～30秒），立即水 洗。 （4）复染：滴加稀释复红染液1～2滴，作用1分钟后水洗。 （5）结果：牙垢标本中革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌 染成红色。其中真菌(白色念珠菌)染成紫色，而螺旋体等 被染成红色。口腔中脱落的组织细胞及个别白细胞被染成 红色。其细胞质呈红色，细胞核呈深红色。
1.药物的微生物限度检查（三）
2.细菌的生长现象及代谢产物的观察 1）液体培养基---沉淀、浑浊、表面生长现象。 2）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特征、溶血环观察。 3）双糖含铁培养基--- 动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。 4）结核杆菌菌落的观察。 3.中草药、抗生素抑菌试验
1）中草药---大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。
医学微生物学实验室规则
一.进入实验室必须穿白大衣,不必需的物品不要 携带入室。 二.保持实验室的安静和秩序,实验要严肃认真。 三.如有传染性材料的污染污染,及时报告老师。 四.实验过程中有仪器和器材的损坏要报告老师 并登记。 五.实验后的材料要放到指定的位置。 六.离开实验室前,要用肥皂洗手,接触过传染性强 的实验材料要用0.1%的新洁尔灭泡手1-2分钟 七.值日生要作好值日工作,关好水,电,门窗,作好 实验记录本的登记方可离开实验室。
• 方法： 1.取洁净玻片，用记号笔画两个圈并标号，其中
一个滴加生理盐水另一个滴加兔血浆。 2.接种环烧灼灭菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理盐 水中研匀混悬，另1/2在兔血浆中研匀混悬，静 止片刻，观察结果。
• 结果：
凝集呈颗粒状判定为血浆凝固酶试验（+）， 呈均匀混浊状不凝集判定为（-）
抗酸染色步骤
红 阳性（+） 红色 阳性（+）
VP
枸椽酸盐(C )
葡萄糖蛋白胨 水2管
枸橼酸盐2管
无色变 阴性（-）
绿无色变 阴性（-）
红色 阳性（+）
绿—蓝色 阳性（+）
IMViC结果
• 吸哚试验：取出后每管滴加柯氏试剂0.5ml，静止片刻，观察有无颜色 改变。大肠埃希菌能够分解色氨酸产生吲哚，加入对二甲基氨基苯甲醛 后形成红色的玫瑰吲哚，则为阳性反应；产气杆菌不产生吲哚，添加试 剂后无颜色变化，为阴性反应。 • 甲基红试验：取出后各管内滴加甲基红试剂数滴。大肠埃希菌分解葡萄 糖产酸较多，培养基的pH值在4.5以下，加入甲基红试剂后呈红色反应， 为阳性结果。产气杆菌分解葡萄糖产生的是乙酰甲基甲醇，酸类较少， 培养基内pH值较高，加入甲基红试剂后呈黄色反应是为阴性。 • ③V-P试验：葡萄糖蛋白胨水中滴加数滴培氏试剂。大肠埃希菌不产生 乙酰甲基甲醇，加入培氏试剂后无颜色反应，为V-P试验阴性 ；产气杆 菌产生的乙酰甲基甲醇能氧化成二乙酰，并和培养基中的精氨酸的胍类 衍生物生成红色化合物。加入培氏试剂后促进反应呈红色为阳性。 • ④枸橼酸盐利用试验 ：枸橼酸盐琼脂斜面， 大肠埃希菌不能利用枸橼 酸盐作碳源，故不生长，培养基仍为绿色。产气杆菌能够利用枸橼酸盐， 故生长良好，而使培养基变碱性。培养基中的指示剂溴麝香草酚蓝在 pH6.0～7.6时颜色由黄→绿→蓝)由黄变蓝，故为阳性。
i. ii. iii. iv.
制片（涂片、干燥、固定）；
石炭酸复红初染（加温、 盖滤纸片） 5min ---水洗；
3％盐酸酒精脱色 （ 15S,水洗）； 美兰复染（1min，水洗 ）-滤纸吸干
v.
镜检。
结核杆菌
抗生素体外抑菌试验（二）
记录纸片法结果
测量抑菌环直径
病毒的分离培养—鸡胚接种
病毒的培养方法： • 动物接种 • 鸡胚培养 • 组织细胞培养
2.外用药 1)判定胆盐乳糖增菌液培养物及亚碲酸钠增菌液培 养物有无细菌生长： 增菌液变混浊―――有 2)细菌鉴定： （1）将胆盐乳糖增菌液培养物无菌接种在16烷三甲 基溴化胺琼脂斜面培养基上面。 方法：斜面化线接种； （2）将亚碲酸钠增菌液培养物，无菌接种在卵黄高 盐琼脂平板培养基上面。 方法：分区划线接种。 37℃恒温孵育箱24小时培养后，观察结果。
二.血浆凝固酶试验
• 原理：非致病性葡萄球菌不产生血浆凝固酶而致
病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使含有枸橼 酸钠或肝素抗凝剂的兔或人等血浆发生凝固。
• 方法： 1.取洁净玻片，用记号笔画两个圈并标号，其中一个滴加 生理盐水另一个滴加兔血浆。 2.接种环烧灼灭菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理盐水中研匀 混悬，另1/2在兔血浆中研匀混悬，静止片刻，观察结 果。 • 结果： 凝集呈颗粒状判定为血浆凝固酶试验（+）， 呈均匀混浊状不凝集判定为（-）
2.细菌培养
外用药 口服药
药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中 药品混悬液10毫升加入亚碲酸钠增菌液中
37℃,24小时
药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中
37℃,24小时
3.细菌总数测定
将剩余口服药以10-1 10-2 10-3 10-4 进行稀释 (以生理盐水稀释)
9ml生理盐水
取四个中试管