第十六章 高效液相色谱法

高效液相色谱

(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)

学习指导与基本要求：

高效液相色谱法又称为高压液相色谱法或高速液相色谱法。它是在经典液相柱色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度的检测器而发展起来的快速分离分析技术，具有分离效率高、检测限低、操作自动化和应用范围广的特点。

具体要求如下：掌握高效液相色谱法和气相色谱法区别和联系；

掌握高效液相色谱仪的组成，采用梯度洗脱的优点；

掌握高效液相色谱仪的检测器：紫外光度检测器、荧光检测器、示差折光检测器工作原理；

掌握影响色谱峰扩展的因素及分离条件选择；

掌握高效液相色谱固定相和流动相；

了解：高效液相色谱分离类型的选择；高效液相色谱在药物分析和临床检验中的应用。

第一节概述

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了自动化 操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9×107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、灵敏度高、操作自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：

一、H P L C与经典L C区别

9主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段

1．经典L C：仅做为一种分离手段

柱内径1~3c m，固定相粒径>100μm且不均匀

常压输送流动相

柱效低（H↑，n↓）

分析周期长

无法在线检测

2．H P L C：分离和分析

柱内径2~6m m，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）

高压输送流动相

柱效高（H↓，n↑）

分析时间大大缩短

可以在线检测

二、H P L C与G C差别

9相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测

9主要差别：分析对象的差别和流动相的差别

1．分析对象

G C：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，

高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及

高聚物的样品不可检测

占有机物的20%

H P L C：溶解后能制成溶液的样品，

不受样品挥发性和热稳定性的限制

分子量大、难气化、热稳定性差及高分子

和离子型样品均可检测

用途广泛，占有机物的80%

2．流动相差别

G C：流动相为惰性气体

¾组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

H P L C：流动相为液体

¾流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用

¾流动相种类较多，选择余地广

¾流动相极性和p H值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相

可以增大分离选择性

3．操作条件差别

G C：加温操作

H P L C：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）

第二节基本理论和条件选择

热力学理论：塔板理论——平衡理论基础

动力学理论：速率理论——V a n d e r方程

一、塔板理论

二、速率理论

三、H P L C法中分离条件的选择

一、塔板理论

二、速率理论（与G C对比）

续前

¾讨论：

1）流动相流速对H P L C板高的影响（与G C对比）n e x t

2）涡流扩散项及其影响

3）传质阻抗项及其影响

三、H P L C法中分离条件的选择

1.固定相与装柱方法的选择：

选粒径小的、分布均匀的球形固定相（d p≤10μm）

首选化学键合相，匀浆法装柱

2.流动相及其流速的选择：

选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1m l/m i n

3.柱温的选择：选室温250C左右

第三节各类高效液相色谱法

一、液固吸附色谱法（L S C）

二、液液分配色谱法（L L C）

三、化学键合相色谱法（B P C）

一、液固吸附色谱法（L S C）：流动相为液体，固定相为固体吸附剂

1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异

¾分离前提：K不等或k不等

2．固定相：与L C比，固定相粒径不同（<10μm）

3．流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关

↑

溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，t

R

溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，t

↓

R

9注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间

5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱