荧光分析法测定邻羟基苯甲酸和间羟基苯甲酸实验

实验五 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸
学号36010712 姓名 张中豪 实验日期 2009 年 3 月 16 日 第 一 组
同组姓名 张雪、张琳琳、傅磊、洪延 1. 学习荧光分析法的基本原理和操作；
教师评定 .
【实验目的】
2. 用荧光分析法进行多组分含量的测定。

【实验原理】
1、荧光分析法原理：
当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态中各种振动状态的一种。

然而由于分子通过与溶剂分子、同类分子或其他分子的碰撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发光。

但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级跃迁至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光既是荧光。

荧光物质的荧光强度与其浓度、分子结构和化学环境（如体系的pH 、温度）有关。

而且与体系所吸收的激发光强度成正比，则：
0()F I I =Φ−
式中，F 为荧光强度；0I 为入射光的强度；I 为通过厚度为b 的介质后的光强度；Φ为量子效率，为发射的光子与吸收的光子之比。

又比尔定律可得：
0(110)bc F I ε−=Φ−
式中，ε为荧光分子的摩尔吸光系数；b 为液槽的厚度；c 为荧光物质的浓度。

对于很稀的溶液，投射到样品溶液上被吸收的激发光不到2%时，即bc ε<0.05时，则上式可近似写为：
02.303F I bc ε=Φ
当入射光强度一定时，实验条件一定时，则 ： F Kc =
即在低浓度时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系，这就是荧光定量分析的基础。

荧光强度和溶液浓度呈线性关系只限于极稀的溶液，对于较浓的溶液，其吸光度超过0.05时荧光强度与浓度的线性关系将发生偏离。

2、激发光谱和发射光谱： （1）激发光谱：
荧光是光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，这可以从它们的激发光谱曲线来确定。

绘制激发光谱曲线时，选择荧光的最大发射波长为测量波长，改变激发光的波长，测量荧光强度的变化。

以激发波长为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，即得到荧光化合物的激发光谱。

激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收关顾不仅形状相同，而且波长位置也一样。

这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。

（2）发射光谱：
发射光谱简称荧光光谱。

如果将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度，即得到荧光光谱。

3、试验方法机理：
邻-羟基苯甲酸（亦称水杨酸）和间-羟基苯甲酸分子组成相同，均含一个能发射荧光的苯环，但因其取代基的位置不同而具有不同的荧光性质。

在pH=12的碱性溶液中，二者在310nm 附近紫外光的激发下均会发射荧光；在pH=5.5的近中性溶液中，间-羟基苯甲酸不发荧光，邻-羟基苯甲酸因分子内形成氢键增加分子刚性而有较强荧光，且其荧光强度与pH=12时相同。

利用此性质，可在pH=5.5时测定二者混合物中邻-羟基苯甲酸含量时，间-羟基苯甲酸不干扰。

另取同样量混合物溶液，测定pH=12时的荧光强度，减去pH=5.5时测得的邻-羟基苯甲酸的荧光强度，即可求出间-羟基苯甲酸的含量。

已有研究表明，二者的浓度在0～12/g mL µ范围内均与其荧光强度呈良好的线性关系，且对-羟基苯甲酸在上述条件下均不会发射荧光，不会干扰测定，故而亦可在邻-羟基苯甲酸、间-羟基苯甲酸、对-羟基苯甲酸三者共存时，用上述方法测定出邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸的含量。

【主要仪器和试剂】
1、 仪器：岛津RF-5301PC 型荧光分光光度计，其基本操作参见附录。

10mL 比色管、分度吸量管。

2、 试剂：
邻-羟基苯甲酸标准溶液：60/g mL µ(水溶液)；间-羟基苯甲酸标准溶液：60/g mL µ（水溶液）； HAc-NaAc 缓冲溶液：47gNaAc 和6g 冰醋酸溶于水并稀释至1L ，得pH=5.5的缓冲溶液； NaOH 水溶液；0.1mol/L
【实验步骤】
1、 配制标准系列和未知溶液：
（1）
分别移取0.40、0.80、1.20、1.60和2.00邻-羟基苯甲酸标准溶液于已知编号的10mL 比色管中，各加入1.0mLpH5.5的HAc-NaAc 缓冲液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。

则各份邻-羟基苯甲酸的标准系列液浓度如下：
（2）
分别移取0.40、0.80、1.20、1.60和2.00间-羟基苯甲酸标准溶液于已编号的10mL 比色管中，各加入1.2mL 0.1mol/L 的NaOH 水溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。

则各份间-羟基苯甲酸的标准系列液浓度如下：
（3）
取未知溶液各2.0mL 于10mL 比色管中，其中一份加入1.0mL pH5.5的HAc-NaAc 缓冲液，另一份加入1.2mL 0.1mol/L 的NaOH 水溶液，均用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。

2、 测定荧光激发光谱和发射光谱：
测定（1）中第三份溶液和（2）中第三份溶液各自的激发光谱和发射光谱。

先固定发射波长为400nm ，
在250～350nm 区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长max ex λ为303.0nm ；再固定激发波长max
ex
λ=303.0nm ，在350～500nm 区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长max em λ403.5nm 。

此时，在光谱中发现在激发光谱max
ex λ=303.0nm 处和发射光谱max em λ=403.5nm 处的荧光
强度基本相同。

3、 荧光强度的测定：
根据上述激发光谱和发射光谱扫描结果，确定一组波长（max em λ=303.0nm 和max
ex λ=403.5nm ），使之对
二组分都有较高的灵敏度，并在此组波长下测定前述标准系列各溶液和未知溶液的荧光强度f I 。

【实验数据及结果】（计算机输出数据见附表）
1、 标准工作曲线的制作：
该实验的定量测定进行了两组并行对照实验，以各标准溶液的f I 为纵坐标，分别以邻-羟基苯甲酸或间-羟基苯甲酸的浓度为横坐标通过计算机拟合制作工作曲线。

得到了四组工作曲线，分别对应四分数据图。

并由一元线性回归的相关系数计算公式：,(,)
x y x y
Cov X Y ρσσ=
得个工作曲线的相关系数，其数据如下：
2、未知溶液中间-羟基苯甲酸和邻-羟基苯甲酸浓度的确定：
通过荧光分光光度计测量并向计算机输入数据，计算机从标准工作曲线上读取数据得到各未知溶液在pH=5.5(含HAc-NaAc缓冲溶液)时的荧光强度和pH=12(含NaOH缓冲液)时的荧光强度并确定与荧光强度相对应的待测物的浓度。

通过pH=5.5时的荧光强度可以定量确定邻-羟基苯甲酸的浓度c邻，通过pH=12时的荧
光强度可以定量确定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸的总浓度c总。

c总-c邻即得间-羟基苯甲酸的浓度c间。

数据如下：
第一组：
由于待测液是由未知液稀释5倍得到的，故可由求得的浓度得到未知液浓度,如下表：
第二组：
由于待测液是由未知液稀释5倍得到的，故可由求得的浓度得到未知液浓度,如下表：
【结果讨论】
由实验结果可以看出，两次实验所得的工作曲线和所测得的未知液浓度不尽相同，而且某些浓度的数据还有比较大的偏差。

综合分析整个实验过程，得到以下结论：
1、本实验我们组共有五人参加，虽然有不同的分工合作，但由于配制溶液工作量较大，配制溶液的
工作由四人分别完成。

在吸量管吸取溶液、比色管定容等操作中，由于每个人的主观判断标准不同，会造成浓度上的误差，引起后来测量数据的偏差。

2、数个比色管的磨口与玻璃塞接触不紧密，在震荡摇匀时溶液内部浓度未达到平衡时即有部分溅出
造成了浓度的偏差。

3、在实验过程中未完成测量时未知液便已用尽，于是重新配制了未知液，由文献说明得知，新制的
羟基苯甲酸必须在1h以内完成测定，否则便会发生变质，故实验前半部分使用的羟基苯甲酸溶液可能已发生变质，会对实验结果产生偏差。

4、标准液中有些许絮状的不容物，在配制标准系列液时不容物也被吸入，会对荧光的激发与发射造
成影响。

5、在使用荧光分光光度计进行测定时，为了提高实验效率，我们组轮番使用两只比色皿盛装溶液进
行测定，由于两只比色皿在厚度、光洁度等方面存在着差异，会对测定结果产生不可忽略的影响。

6、在使用同一支比色皿时，每一次放置的方向也没有做到都相同，用一支比色皿的不同壁也会在厚
度、光洁度等方面存在差异，也会造成误差。

7、每次比色皿使用完毕后只是用去离子水冲洗，不经烘干只用待测液润洗便进行下一组实验，一方
面可能会残留下前一组实验的待测液，对浓度产生影响，另一方面不经烘干只润洗难以消除由于比色皿残余水而对待测液浓度产生的影响。

8、由于该实验使用的比色皿没有毛玻璃面，故在实验过程中操作者的手难免会接触到光学面，污染
了比色皿，对实验结果造成影响，而且用擦镜纸擦拭比色皿时会残留下纸纤维，也会对实验结果造成影响。

9、查阅资料得知，温度的变化会对分子荧光发射造成影响，在实验过程中由于机器的工作，荧光分
光光度计测试室里的温度会逐渐升高，故对测定结果产生了影响。

【注意事项】
1、 使用仪器开机时，先点燃氙灯，才能开启计算机。

2、 关机时，先关计算机，后关主机电源。

3、 定量操作时（工作曲线制作，未知液测定）时应保持仪器参数设置一致。

4、 注意保护比色皿的窗面透明度，防止被硬物划伤。

拿取时，手指应捏住池的两棱，以免沾污或磨损光
面。

5、 倒入溶液前，应先用该溶液淋洗内壁三次，倒入量不可过多，以液池高度的4/5为宜。

然后用吸水性
好的软纸吸干外壁水珠，放入样品池。

每次使用完毕后，应立即弃去样品溶液，先后用自来水、弱碱洗涤剂、蒸馏水仔细淋洗，严重污染的液池可用体积分数为50%的稀硝酸浸泡，或用有机溶剂如三氯甲烷、四氢呋喃溶液除去有机污染物。

洗涤干净后，晾干，置于液池盒内保存。

6、 测定完毕时，关闭所有电源开关，并做好仪器使用登记整理和清洁工作。

检查好安全后方可离开实验
室。

7、 在测定时溶液浓度由低到高进行测定，减小误差。

8、 新制的溶液测定尽量于一小时内完成，时间延长会导致羟基苯甲酸变质。

【思考题】
1、max ex λ和max em λ各代表什么？为什么对某种组分，其max ex λ和max
em λ荧光强度应基本相同？
答：（1）max ex λ代表荧光的最大激发波长，用此波长照射分子会产生最大强度的荧光发射； max
em λ代表荧光
的最大发射波长，分子受激发后在此波长处荧光发射强度最大。

（2）电子由单重态基态S 0态跃迁到单重态第一激发态S 1max
ex
λ态各振动能级时产生的吸收光谱（最高峰为
），其形状决定于分子S 1态中各振动能级能量间隔的分布情况（称该分子的第一吸收带），而分子由S 1态的最低振动能级至S 0max
em λ态各振动能级所产生荧光光谱（其最高峰为）同样有多个峰，也就是说，荧光
光谱的形状取决于S 0态中各振动能级的能量间隔分布。

而分子的S 0态和S 1max ex λ态中各振动能级的分布情况相
似，故荧光光谱和吸收光谱的形状相似，进而可知对某种特定组分，其和max em λ荧光强度基本相同。

2、pH=5.5时，邻-羟基苯甲酸（pKa1=3.00.pKa2=12.38）和间-羟基苯甲酸（pKa1=4.05,pKa2=9.85）水溶液中的主要存在的酸、碱型体是什么？为什么二者的荧光性质不同？ 答：：ph=5.5时，邻-羟基苯甲酸的型体如下图所示：
而间-羟基苯甲酸的型体如下图所示：
O
二者荧光性质不同是因为在ph=5.5的条件下，邻-羟基苯甲酸可以在分子内形成氢键增加分子刚性而有较强的荧光，而间-羟基苯甲酸则不能。

3、从本实验可总结出几条影响物质荧光强度的因素？
答：(1)分子结构的影响：从本实验中可看出取代基的位置会影响物质荧光强度，邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸由于取代基位置的不同，故而溶液中形成的共轭酸碱型体不同而具有不同的电子氛围，导致邻-羟基苯甲酸形成分子内氢键而间-羟基苯甲酸没有，从而导致了不同荧光强度。

（2）溶液pH 的影响：在pH=5.5的环境下间-羟基苯甲酸不发生荧光而在pH=12的时候则发生荧光。