第二章基因工程制药二

粒）
第二章 基因工程制药
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表达载体
普通表达载体：只能方便地引入外源基因并
进行表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末 端氨基酸是否有增减并无严格要求。
精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码
序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源 基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列 与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失 的氨基酸。
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载体的复制系列
分四类：
Yep类（yeast episomal plasmid，酵母附加体质粒） YRp类（yeast replication plasmid，酵母复制型
质粒） YCp类（yeast centromeric plasmid，酵母着丝粒
质粒） YIp类（yeast integrative plasmid，酵母整合型质
第二章 基因工程制药 (二）
第二章 基因工程制药
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影响目的基因在大肠杆菌中 表达的因素
外源基因在宿主中的表达受许多因 素影响的，所以在建立表达体系时 要综合考虑各种因素的作用，建立 一个合适的表达体系，从而使外源 基因得到最大的表达量，获得最多 的表达产物。
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外源基因的拷贝数
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工程菌的培养条件
除宿主、载体和克隆基因三者之间 的关系影响外源基因的高水平表达 外，培养条件亦是非常值得研究的 因素。
优化培养条件使外源基因大量表达。
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真核基因在大肠杆菌中的表达形式
三种表达形式： 融合蛋白 非融合蛋白 分泌型。
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外源基因的表达效率
要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆 到酵母军表达载体的启动子和终止子之间，构成 表达框架。
分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码 序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞， 并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物 与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。
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非融合蛋白形式表达药物基因
非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的 蛋白质以真核蛋白的mRNA的 AUG为起始，在其氨基端不含细 菌多肽序列。
优点：保持原有蛋白活性。 缺点：易被蛋白酶破坏。
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分泌型表达药物基因
将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质 内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进 入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时， 被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物 活性的外源基因表达产物。
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表达产物的稳定性
利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中 自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞 浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶 降解；
组建融合基因，产生融合蛋白；
采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋 白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定 性；
选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。
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不大
酵 母 多肽蛋白质 菌体内 糖基化蛋白 外分泌
缺点：
细胞生长慢，生产率低 条件刻苛，费用高 培养液浓度较小 表达的外源细胞均为传代细胞 表达产物是否致癌尚有疑问
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主要基因工程表达体系比较
表达体系
产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危险性
大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 融合蛋白质
容易
一般
部分高产
对原核好 对真核差
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影响目的基因在酵母菌中表达的因素
外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率 外源蛋白的糖基化 宿主菌株的影响
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外源基因的拷贝数
拷贝数要适当，高拷贝数的质 粒载体可使外源基因高效表达， 但会引起细胞生长量的降低， 单拷贝的质粒载体对细胞的最 大生长没有影响，能达到较高 效的表达。
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细胞的代谢负荷
外源基因的表达产物属于异己物质，并可能对宿 主细胞有毒性。调节表达物质的积累与细胞的生 长和代谢之间的平衡有利于外源基因的高效表达。
另外通过将细胞的生长和外源基因的表达分成两 个阶段，或将宿主细胞的生长与重组质粒的复制 分开两种手段也可以减轻细胞代谢的负荷。
形成不溶性的包含体可以降低表达产物对宿主细 胞的毒害作用。
终止序列保证了转录产物在适当的部位终止和加 上多聚腺苷酸尾巴，这样形成的mRNA可能比较 稳定并被有效地翻译。
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外源蛋白的糖基化
外源蛋白在酵母细胞中可发生N-糖 苷键和O-糖苷键连接的两种不同的 糖基化。
外源蛋白经糖基化后可以以有效的 活性型分泌到培养基中。
某些蛋白质糖基化后更加稳定，便 于分离精制。
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融合蛋白形式表达药物基因
融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是 真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原 核多肽和真核蛋白结合在一起的。
优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定， 易实现高效表达。
缺点：只能作抗原用。原核多肽序列可能 会影响真核蛋白的免疫原性。可再切割成 两个多肽链。
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宿主菌株的影响
菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要较弱 菌体性能稳定 分泌能力强
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动物细胞中的基因表达
优点：
哺乳动物细胞外源基因表达产物可由 重组转化的细胞分泌到培养 液中，使 产物易纯化。
基因产物糖基化接近天然产物。
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动物细胞中的基因表达
外源基因是克隆到载体上的，所以 载体在宿主中的拷贝数就直接与外 源基因的表达相关，应将外源基因 克隆到高拷贝的质粒载体上，这对 于提高外源基因的总体表达水平非 常有利。
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外源基因的表达效率
启动子的强弱 核糖体接合位点的有效性 SD序列和起始密码ATG的间距 密码子组成
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优点：在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨 酸残基。
缺点：产量不高， 信号肽不被切割。
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酵母中的基因表达
载体：
酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细 胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子 代细胞的DNA 或RNA单位。
从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易 得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分 是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段 在转入酵母中。