乳鼠心肌细胞的培养方法

关键 词 乳 鼠心肌细胞 ；细胞培养 ；方法
中 图分 类号 Ｒ 文献 标识 码 Ａ 文 章编 号 １７— ６１（００ ６— １５０ ３ ６ ３９７一２ １） １０ １— １ ０
１ 材 料
所需液体 ：Ｈ ｎ ｓ 、低糖 Ｄ Ｍ液 、高糖Ｄ Ｍ液、胰酶消化液、 ａｋ液 ＭＥ ＭＥ 双抗液、碳酸氢钠液 、盐酸液。 试剂 ：Ｔｙｓ ｒｐｉ Ｄ ，Ｄ Ｍ均购于Ｓｇ ａ ｈｍｉ ｌｏ 牛血清购于杭 ｎ，Ｓ Ｓ ＭＥ ｉｍ Ｃ ｅ ｃ Ｃ 小 ａ 州四季青生物制 品有限公司 ，其余均为国产分析纯。 取 鼠 ：标 准 Ｓ 大 鼠 ，鼠 盆用 棉 铺 好 ，取 鼠。 Ｄ 物 品：白大衣 、饭盒 ；小剪子 、小镊子 （ 套 ） （ ４ 一套剪皮肤 、一 套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织 ，—套剪碎心脏Baidu Nhomakorabea）；瓶皿 （ 套 ）； ２ ２０ 烧杯 ３ ；５ ０ １ 杯 １ ，用 作 废液 缸 ；５ｍ 烧 杯 ３ （ ５ｍｌ 个 ０ ｍ￣ 个 Ｏｌ 个 剪碎 心 肌 组 织 ，最后配液 ）；三角烧杯 （ ０ １ ５ ｍ ）小转子 （ 小转子 ，酒精擦，双蒸水冲 后 ，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压 ）；离心管及帽 （ ２ ｌ个 ）， １一４ 两个试管 ；吸管 （ — 个 ）大镊子 （ ５８ 两把 ，持物，例夹棉球等 ）；台面 ： 磁力搅拌器、纱布 （ 事先用于托盘装０１ ．％新洁尔灭浸泡 ）、试管架 、泡 沫塑料板 、五个针头 （ 不用消毒 ）７ ％酒精棉球及碘酒 （ ５ 消毒棉球 ，泡 酒精 、碘酒 ）大镊子两把 （ 一把夹棉球 ，一把取鼠 ）、３ ５ ｍ烧瓶 （ ￣２０ ｌ 一 个装一蒸水 ，一个装新洁尔灭 ，另一为空的备用 ）１ ｏ ｍ唬 瓶 （ 个５０ 废液 缸 ）、温度计 、Ｐ 试纸 （ Ｈ 事先调Ｐ 值 ）、酒精灯 、打火机， Ｈ 火柴、载玻 片 （ －Ｏ ）、注射器５ ６ （ ５ １个 ｍ１个 胰酶、Ｄ Ｍ、小牛血清 ）ｌ １￣ （ ＭＥ ｍ２ 双抗 液）０ｌ ２ ｍ备用２ 个、微量加样器１０ｍ及５０ ｌ ００ ｌ ０ ｍ 。 以上 物 品均 用 紫外 线 照 ３分 钟 。 Ｏ 另外准备手套 、帽子 、 口罩 、２ 孔 培养板 、离心机 、未冻药 品及 ４
１ Ｏ）消化到４ 次左右 ，吹打均匀后 ，吸一滴滴在 载玻 片上，拿到镜 下观察消化情况 ，决定消化次数。 ｌ ）离心２ 的吸管 ，放在试管架上 ，待离心过程全部完事后 ，把 １ 次 各管上清液倒 掉，在各管加上３ ｌ（ ｍ 不用精确 ，大致这样 ）Ｄ Ｍ液 ，记 ＭＥ 住共加入多少Ｄ Ｍ液的量 ，换吸管 （ 号 ）把各管底细胞块 吸下吹打均 ＭＥ ３ 匀后 ，移人５ ｍ 烧杯中，然后用注射器抽取余量 的Ｄ Ｍ ０ｌ ＭＥ 加入烧杯 中， 加入小牛血清及抗 生素 ，换吸管 （ 号 ）吹打均匀 。 ４ １ ）取出２ 孔培养板 ，一个人吹打 ，另一个人用加样器加药 。封盖 ２ ４ 时过火 ，盖上盖 ，放在Ｃ Ｏ 孵箱。２ 小时后观 察是否贴壁 。 （ ４ 生物秀实 验频道ｗ ｗｂ ｉ ． ｍ） （ ４ ｗ ．ｂｏ ｃ ｏｏ ２ 孔板 ，每孔最多Ｊ ２ ，一般加液时每孔加 Ｊ ｍｌ ｎ
出台面。消毒、清洁 ，铺纱布 、换手套 。 ３）用第 三副剪 子和镊 子把圆皿中的心脏周边 的血凝 及纤维 组织剔 除掉 ，放在另一个预先装好 Ｄ Ｍ的圆皿中。抽取５ ｌ ＭＥ ｍ 的胰酶，然后将其 中少许放入５ ｍ 的小烧杯 中，大部分倒人 角烧瓶中。用第 四副剪子将 ０ｌ 烧杯中的心脏剪成 ｌ ｍ ｍ 的碎块 ，倒人三角烧瓶中 （ 可用剪刀刮人 ），再 用剩 余 胰 酶 刷净 烧 杯 。 ４）把温 度计和三角烧 杯放入２ ０ ｌ 瓶 中， （ ５ ｍ烧 事先 调好水量 ，多 会 没过三角烧杯 ，少温度会不均匀 ）。打开磁力搅拌器 电源 ，调温度 （ 缓慢加到３ —５ ）和转速 （ 使一 ４ ３℃ 转速不可过快 ，否则会打碎细胞 ，基 本上标志为平行 ）。一定要注意监控。 ５）温度达到３ ℃时开始计 时，第一次为１ 分钟 ，以后可为８ ４ Ｏ 分钟 ， 事情 况而定 。在此期 间 ，在试管架上摆上５、６ 个离心管 ，标 上１ ， 、１ ２ 。其 中在１ 、２ 号两管事先加入Ｄ Ｍ液各２ ＭＥ 毫升 。 ６）ｌ ５ 钟后 ，把三角烧瓶取下 ，磁力搅拌器关上 ，用一个吸管轻 ｏＹ 轻吹打 （ 消化下来的细胞 彻底从组织团快上掉下来 ），这个吸管①用 使 后 固定放 在一个离心管 中 ，以后每次消化后 取下都用其吹打几 下 ， 第 次上清弃 去，然后向两个１ 号管分别倒人２ ＿ 清 （ 量不要把组织倒 ｍｌ ｋ 尽 出 ，也不要剩液太多 ，以免 消化下的细胞重复消化造成损 伤 ），用另一 个吸管 。②混匀配平两个管 （ 即两个管水平高度相同 ）， 轻轻吹打 ，以 免损 坏 细 胞 。 ７）接着把这两个离心管放人离心机中，调 ｌ分钟 ，８０ ｌＯ ￣ ， Ｏ ０ 或 ＯＯ 打开关 。 ８）同时 向三 角 烧 瓶 中加 入 ５ 胰 酶 ，继 续 消 化 ８ 钟 ，注 意 控 制 温 ｍｌ 分 度。此时向两个２ 号管 中分另） Ａ２ ｌＭＥ ｔ ｎ ｍＤ Ｍ液。 Ｊ Ｊ ９）取下三角烧瓶 ，仍用 ｌ 号吸管吹打 ，后静置片刻 向两个２ 号管分 别 倒 人 ２ 升 的上 清 ，取 出 两个 离 心后 的 １ 管 ，把 上 清 液 沿 细胞 贴 壁 一 毫 号 方慢慢倒掉 ，后向其中一管加入４ 的Ｄ Ｍ液 ，用２ ｍｌ ＭＥ 号吸管取少量液体 加入另一个离心管 中，把管底 的沉淀细胞洗下来 ，把液体全部移入其中 管 ，三个管 （ 个 ｌ １ 号管 ，两个２ 号管 ） 配平 ，放人离心管中 ，离心十 分 钟 。 同时 仍 ￣ ５ 的 胰 酶 ，放 人 三 角 烧 瓶 中 ，继 续 消 化 （ 意 控 制温 ｌ ｍｌ １ 注
翥霾
应 用 科 学
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乳 鼠心肌 细胞 的培 养 方 法
王 爽
（ 黑龙江生态工程职业学院生 物技术 系 ，黑龙江哈尔滨 １０ ２ ５ ０ ５）
摘 要 细胞 培养是用无 菌操作 的方 法将动物体 内的组织 （ 或器官 ） 出 ，模拟动物 体内的生理 条件 ，在体 外进行培养 ．使其不 断地生长 、 取 繁殖 ，人们借 以观察细胞 的生长 、繁殖 ；细胞分化 以及细胞衰 老等过程 的生命 现象 。对 乳 鼠心肌 细胞的培养进 行理论和实 验探讨 。
Ｄ Ｍ、ＨＣ 、Ｎ Ｈ Ｏ 、小 牛血 清 。 ＭＥ Ｌ ａＣ
事先把显微镜 、离心机、磁力搅拌器电源插好 。检查酒精灯是否有 酒精 ，碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入 ，后穿大衣、帽子和 口 罩。然后把酒精灯打开 ，把瓶皿摆好，再用一个瓶皿装酒精棉球。
２ 培 养 方 法 乳 鼠心肌 细 胞 属 于原 代 生 长 细 胞 ，培养 过 程 较 为 繁 琐 。文 献 上 有 多
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度 ，达３ ℃ 时计 时 ）。 ４
肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同 ，采用差速贴壁１ ，除去成纤维细 ｈ 胞 ，达 到 纯化 的 目的 。成 纤 维 细 胞胞 体 呈 梭 型 或 不规 则 三 角 形 ，中 央有 卵 圆形核 ，胞质 突 起 ，生 长 时呈 放 射状 。 事 先检查 显微镜 、磁力搅 拌器及离心机是 否好用 ，提前三小时把 小牛血清、胰酶 、抗生素拿出来 化开 。其余未冻药 品也提前２ 分钟拿出 Ｏ 来 缓 和 一 下 。新 洁尔 灭 （ ．％ ）泡 纱 布 （ １ｍ５ 的新 洁 尔 灭 加 水 至 ０１ 用 ０ １％ ５ｏ ｌ ｏ ｍ 即得 ），消毒地面 （ ： ０ ４ ），用酒精棉球擦拭 台面后把物 １ ０ 的８ 液 ５ 品摆放好 ，开紫外线灯照３ ＳＣ后 开鼓风机吹至实验结束。 ａＦ ｏ 具体方法 ： １ ）把两个 ５ 注射器分别插入ＤＭＥ ｍｌ Ｍ和胰 酶中，分别 向两个圆皿 中 加入５ 的Ｄ Ｍ培养液。用一把大镊子从 鼠盆里取 出一只生后２ ３ ｍｌ ＭＥ — 天的 Ｓ 大 鼠 ，放人 ０１ Ｄ ．％新 洁尔 灭 浸 泡一 下 后 拿 出放 在 泡沫 板 上 ，用 针 头 把 鼠
固定 （ 位置摆正 ），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤 ， 再用酒精棉球 脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮 ，充分撕拉开 ，再用酒精棉球消毒 ， 后换 另 一把 小 剪子 和镊子 在 剑 突 处正 中 线稍 偏 左 开胸 取 心 。 ２） 取出的心放在刚才准备的—个装有Ｄ Ｍ的圆皿中再取下一只。 ＭＥ 重复以上过程。 （鼠全部杀死后 ，把取 鼠镊及泡沫板 、新洁尔灭缸等拿
１ １ ｍ ）。 －． Ｊ ５
３ 讨论
心肌细胞刚接种 时形状为 圆形 或椭圆形 ，大约 在一天左右基 本贴 壁 ，此 时细胞 伸出伪足 ，伪足在镜下为纤维状 条索 ，细胞胞体则呈现 不规则形 状 ，如多角形 ，部分细胞有聚集倾 向 ，细胞搏动效果较好 ， Ｄ Ｍ培养基在初始培养 时为深红色 ，两天后变为淡黄色 ，应该是 营养 ＭＥ 成分下 降的表现 ，也说明细胞生长状况 良好 。
种浓度胰酶消化方法 ，我们在试验 中摸索Ｎｏ ６ ． ％浓度 的胰酶对细胞 损 ０ 害较小 ，比起一些文献记载 的０１％浓度有一定 的优越性 ，但这个浓度 ．５
消 化所 需 时 间较 长 ，所 以 我们 又 采 取 多 次反 复 低 浓度 消化 的方 法 ，每次 消 化 一 些 后 ，用 吸 管 抽 取 出 上清 液 ，离 心 所 得 即 为 心 肌 细 胞 。利 用 心