原代内皮细胞的分离与培养

原代内皮细胞的分离与培养

材料

1. PBS

3. DMEM/F12.

5. 青霉素G (5000 U/mL) +链霉素(5000 μg/mL).

6. 内皮细胞生长添加剂（ECGS）.

7. 肝素.

8. 热处理FBS。56°C，30 min (see Note 1).

9. HUVEC培养基(Table 1).使用前加温到室温或37°C 。建议分装到50-mL 管，4°C储存，直至使用。避免重复加温和冷却。

10. 胶原酶A(Sigma). 13mg/100mL 溶解到无血清的DMEM/F-12，含青霉素和链霉素分别50 U/mL 和50 μg/mL。0.2-μm filter过滤。应该现用现配。

11. 胰蛋白酶EDTA.A5X储备液（Table2）.0.2-μm filter过滤消毒。以10-mL 分装入50-mL 管，-20°C储存。使用前加40 mL无菌去离子水稀释到1X。4°C保存可达到4 周。

12. 纱布(高压灭菌).

13. 套管。

14. 双向开关活塞。

15. 止血钳。

16. 尼龙绳。

17. 手术刀片。

18. 烧杯。

19. 酒精。

20. O.2-μm 滤膜。

21. 漂白粉。

22. 30-mL 注射器。

23. 0.2%明胶。，2% 明胶储备液1 mL 稀释到9 mL PBS制成0.2%明胶工作液10 mL。

24. 50-mL管。

25.100-mm 组织培养板(Falcon).

26. Ficoll-Paque (Amersham).

29. HUVEC冷培养基。需要容量的45% FBS、45% HUVEC培养基和10%二甲基亚砜(DMSO)混合，需要时现配。使用前必须是冰冷的。

30. 抗体：兔抗人vWF) (Dako), 羊抗人VE-cadherin (Santa Cruz).

31. 4%多聚甲醛(Fisher)。在通风橱内，加热到65°e，每100mL PBS溶解4g多聚甲醛。逐滴加入1 M NaOH 直至溶液变清。用0.5 M HCI调整pH 7.0 ，S 4°C储存。

32. Dil-conjugated 乙酰化的LDL(AcLDL)(Molecular Probes). (光敏感)。用无血清的MCDB稀释成10μg/mL。

33. DAPI(4',6-diamidino-2-phenyindole)(Sigma) (光敏感). 水溶解成2 mg/mL 的储备液。储备液分装，-20°e储存。每10mL PBS溶解5μL储备液制成l μg/mL 的工作液。工作液避光储存于4°C，最长2周。

Table 1 Preparation of HUVEC Medium

DMEM/F-12 To final volume of 500ml

Table 2 Preparation of Trypsin EDTA (5X)

Methods

HUVEC的分离。

下面的方法7-10 d 在100mm的培养皿融合成单细胞层。(see Note 2).

1新鲜的脐静脉(less than 24 h old) 置于无菌容器，储存于4°C 直至使用。(see Note 3). 2开始之前打开生物安全罩至少15 min，喷洒70%酒精风干。

3准备胶原酶溶液，预温至37°C。长13-20CM的脐带需要约25 mL胶原酶溶液。

4在生物安全罩内从容器取出脐带。70%酒精轻微浸泡纱布，包裹脐带的一端。轻轻捏住纱布擦拭脐带到另一端，清除表面血液和清除腔内的凝血块。(see Note4).

5将导管插入脐静脉的一端；

6用尼龙线在适当位置固定导管。

7连接双向开关到导管。

8关闭双向阀。拔出注射器的活塞并把注射器连接到双向开关。25 mL PBS充满注射器。插入活塞，打开双向阀并放脐带的开口端在大废物烧杯上。慢慢用PBS冲洗脐带。冲掉红细胞和小血凝块，直至洗出的液体变得清亮。(see Note 5).

9关闭双向阀，分离注射器，拔出活塞，重新连接注射器到双向开关。不要在连接到注射器时拔出活塞，这样产生的真空就会把组织和血液吸入导管。用预温的胶原酶溶液充满注射器。(see Note 6)在插入活塞，打开双向阀。用胶原酶溶液冲洗掉脐带内的PBS。用止血钳夹紧脐带末端。慢慢用胶原酶充盈脐静脉。一旦脐静脉膨胀，关闭双向阀，轻轻搓揉脐带，使胶原酶分布均匀。室温放置30min。

10. 放明胶溶液进入培养瓶以完全覆盖底部。建议：60-mm 的培养皿3 mL，100 mm 的7 mL 。在生物安全罩内，室温下静置20 min。吸出明胶溶液并让参与溶液蒸发直至无液体残留。一旦表面干燥盖回盖子。(see Note 7).

11.轻轻搓揉脐带挤出内皮细胞。(see Note 8).

12. 把钳夹的一端放在50-mL管上。打开阀门，轻轻用剩余的胶原溶液冲出内皮细胞。

13. 用3倍于脐带内的胶原溶液的PBS灌注脐带，收集溶液在同一管内。

14. 在一个吊桶式转头中，以4°C离心细胞悬液，300g，5min。

15. 在生物安全厨内，用无菌巴斯德吸管吸出上清，把小细胞粒留在管中。

16. 15mL PBS重悬浮细胞粒并离心5min。

17. 轻轻的重新悬浮细胞粒在HUVEC培养基。悬浮容量依赖于细胞粒的大小和选择的培养皿。例如，用20cm长的脐带，以5-mL容量平铺细胞在60-mm 培养皿。两个20cm长的脐带，以10-mL容量平铺细胞在100-mm 培养皿。

18. 平铺细胞在之前用0.2%明胶包被的培养皿上。孵育培养皿在37°C in 5% CO2+95% air.

19. 过夜孵育后，其培养基，用PBS洗，移除漂浮的红细胞。加入新鲜的HUVEC培养基。应可见粘附细胞的集落。

20. 每3天更换新鲜培养基，直至融合的单细胞层形成。

原代内皮细胞的传代培养

Passaging Primary Endothelial Cells

HUVECs一般最多能传8-10 代。

使用前，PBS、胰蛋白酶-EDTA和HUVEC 培养基应该加温到室温或37°C。

1. 在溶合或接近溶合时，从原代培养的HUVECs培养皿内吸出培养基。

2. 用5mLPBS洗100-mm培养皿内的单层细胞。(2mL，60-mm) (see Note 13).

3. 吸出。

4. 加2mL溶解于PBS的胰蛋白酶-EDTA，覆盖单层细胞表面。

5. 37°C孵育细胞1-3 min。

6. 显微镜检查细胞是否分离，如果细胞呈圆形但没有分离，可轻轻敲打培养皿使细胞分离。

7. 直接加5mL全成分HUVEC培养基，其的血清将消除胰蛋白酶的活性。

8. 把稀释的细胞悬液移入明胶预包被的培养皿。

9. 用全成分HUVEC培养基把每个培养皿最终容量加到8-10mL (see Note 14).

10. 孵育培养皿37°C-5%CO2 +95% air。每2-3 d更换培养基。

原代内皮细胞的低温储藏（Cryopreservation）

推荐：尽可能传几代就要冷冻HUVECs ，以确保储备足够量的低代细胞以备后续试验。

1. 用适当数字标记好冷冻管，包括冷冻日期和代数，并冰上预冷。

2. 选择未完全融合的培养皿(最好是第二代HUVEC)，向前面描述的用胰蛋白酶消化。悬浮细胞在10 mL新鲜的HUVEC培养基，转移到15-mL管。

3. 300g 离心5min，重悬浮细胞在1mL HUVEC培养基。

4. 准备细胞计数：转移50μL细胞悬液在微离心管，加50μL 0.4% 台盼蓝溶液。

5. 混合并用移液管加到细胞计数器的两个小室，计数并计算细胞浓度。

6. 用5mL HUVEC培养基加入试管，并300g离心5min。

7. 吸出大多数培养基并在冰上冷却(1-2min)。

8.重悬浮细胞在冰冷的培养基，理想浓度：5x 105~1x 106/mL.

9.按l-mL分装至遇冷的标记好的冷冻管。

10. 把冷冻管放在聚苯乙烯泡沫架上，在-80°C冷冻24 h (see Note 15).

11. 转移冷冻管至液氮nitrogen长期保存。