小鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法的比较

小鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法的比较
【关键词】星形胶质细胞;,离体培养;,反应性星形胶质细胞;bystin
［摘要］目的: 比较离体纯化和培养星形胶质细胞的不同方法，旨在获得高纯度的星形胶质细胞，为进一步研究奠定基础。

方法: :用原代培养、传代纯化和一次或两次振荡纯化的方法培养星形胶质细胞。

结果: 原代培养的星形胶质细胞纯度不高;经传代纯化培养后纯度达到99%以上，bystin表达量较少，且能经短时间模拟缺血诱导活性明显增高;经振荡纯化后bystin表达量明显增多，GFAP免疫荧光变亮，能耐受长时间模拟缺血，提示经振荡后星形胶质细胞已经处于“活化”阶段。

结论: 经过传代Na3VO4， NaF是磷酸酶抑制剂，如果你作的蛋白是磷酸酶建议不要加。

Aprotinin, leupeptin, pepstatin是蛋白酶抑制剂比较昂贵，如果没条件，只加PMSF也可以，但必须严格操作，防止蛋白降解。

提取的蛋白放－70保存。

纯化的星形胶质细胞纯度最高，可以经模拟缺血诱导成反应性星形胶质细胞，因此能更好地反映其在脑中的功能，是研究星形胶质细胞在脑中的功能和反应性星形胶质细胞较好的培养方法。

［关键词］星形胶质细胞; 离体培养; 反应性星形胶质细胞;bystin
T o establish a cultural method of astrocytes by comparison of different ways of isolation astrocytes from mouse cerebral
DU Fang，WU Xiao-mei，ZHU Li
（Institute of Nautical Medicine，Nantong University，Nantong Jiangsu 226001，China）
［Abstract］Objective: Comparing different ways of isolation and purify astrocytes from mouse cerebral tissue to establish an optimal culture method of astrocytes for future study of their functions in the brain. Methods: To acquire purified astrocytes by four usually used cultural methods: primary culture，subculture for three times，shanken overnight once or twice. Results: The purity of primary culture was the lowest，with the method of being subcultured for three times the purest，appear>99% pure. The expression of bys- tin was low and cell ability could be enhanced by short-timed simulated ischemia with the subcultural meth-od. Astrocytes purified by being shanken overnight once or twice highly expressed bystin，immunocytochem-ical staining with anti-mouse GFAP was brighter and could endure simulated ischemia for longer time，which demonstrated that the astrocytes might have been activated by shaking. Conclusion: With the subcultural method we can acquire the purest astrocytes in vitro，
which can be induced to reactive astrocytes by simula-ted ischemia，and can best reflect their functions in the brain. It′s an optimal method to acquire the astro-cytes for future study of their functions in vivo and reactive astrocytes.
［Key words］astrocyte; in vitro; reactive astrocyte; bystin
在中枢神经系统中，胶质细胞是主要的组成部分，其中星形胶质细胞在中枢神经系统中发挥着多种作用，组成血脑脊液屏障，营养和支持神经元，与神经元突触的发生有着密切联系［1］。

星形胶质细胞在形态学上可按突起的形状分为纤维性星形胶质细胞（fibrous astrocyte）与原浆性星形胶质细胞（pro-toplasmic astrocyte）二大类，纤维性星形胶质细胞突起明显细长，分支少，亦称蜘蛛细胞（spider cell）; 原浆性星形胶质细胞突起粗短，形成绒球片状，也称苔状细胞（mossy cell［2］。

在受到一定程度的刺激时，星形胶质细胞会表现出胞体变大，突触变长，交织成网的“反应性星形胶质细胞”（reactive astrocyte）的形态特征，并伴随着一系列功能改变。

星形胶质细胞反应性变化的机制与这种变化对神经系统的影响一直以来都是该研究领域受关注的热门课题。

多种刺激因素如缺氧、炎性刺激等均可诱导离体培养的星形胶质细胞变为反应性星形胶质细胞［3，4］，诱导离体的星形胶质细胞“活化”为研究中枢神经系统受到外界刺激时的星形胶质细胞功能变化提供了较好的研究模型。

虽然获取星形胶质细胞的方法较多，但一般研究偏重星形胶质细胞的纯度而较少关注其生物学特性［5，6］。

本研究将文献常报道的几种方法进行比较，从而获得一种纯度既高，又不改变其生物学特性，能反映其在脑中功能的星形胶质细胞纯化方法。

1 材料和方法
1.1 试验动物
选用新生1 d的ICR小鼠，每次15只，雌雄不拘。

1.2 主要仪器与试剂
DMEM（GIBCO公司），L-多聚赖氨酸、胰蛋白酶（SIGMA公司），新生牛血清（杭州四季青生物公司），小鼠抗羊神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）单抗（chemicon 公司），bystin 多克隆抗体（受赠于上海中科院生化与细胞所周嘉伟博士），抗β-actin单克隆抗体（SIGMA公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠和羊抗兔IgG（Pierce公司）。

仪器:CO2培养箱（5400，NAPCO）、三气培养箱（7101FC-1，NAP- CO），全自动酶标仪（Elx800，Bio-TEK），电泳和蛋白转膜设备（Bio-Rad公司）。

1.3 新生小鼠大脑皮层星形胶质细胞培养
无菌条件下分离出小鼠大脑皮质，在D-Hank′s平衡盐溶液中漂洗3遍，彻底剔除脑膜和表面血管，剪碎后用终浓度为0.25 g/L胰蛋白酶37 °C消化15min，用含15%新生牛血清的DMEM完全培养液终止消化，差速贴壁0.5 h，以5×106/ml左右的细胞密度加入
预先铺多聚赖氨酸的25 cm2培养瓶或96孔板中，置37°C CO2培养箱内培养。

按以下四种方法进行星形胶质细胞培养:（1）培养20 d，每3d用上述完全培养基换液一次，此为“原代培养”; （2）培养第14～16天在摇床上以180 r/min 振荡过夜一次（DMEM基培，37 °C，18 h），此为“一次振荡纯化”; （3）方法（2）基础上隔天再以同样的方法振荡第二次，此为“二次振荡纯化”; （4）原代培养（3d换液一次）第12天开始每4 d传一代，共传三次，每次传代均差速贴壁0.5 h，实验取传三代（即第四代）的星形胶质细胞，终密度为1×106/ml左右，于传代后7 d进行实验，此为“传代纯化”。

上述细胞培养在96孔板中用于MTT实验;25 cm2培养瓶提取全细胞裂解液用于蛋白质免疫印迹实验;培养于盖玻片的细胞用于免疫荧光实验。

1.4 离体培养的星形胶质细胞模拟缺血
将星形胶质细胞培养基撤去，用无糖Hank′s溶液洗两遍，置37°C三气培养箱（1%O2+94%N2+5%CO2）内不同时间后换成含15%新生牛血清的DMEM完全培养液，在CO2培养箱（21%O2）复氧24 h。

1.5 胶原纤维酸性蛋白（GFAP）鉴定
按文献［4］方法，将不同方法培养的星形胶质细胞4%低聚甲醛固定，抗GFAP抗体孵育，二抗为抗FITC抗体，荧光显微镜拍照，阳性细胞记数。

1.6 MTT代谢率法检测细胞活性
各组细胞培养于96孔培养板，将各处理组，用Hank′s洗2遍，每孔加入25μL MTT （5g/L）溶液，37 ℃孵育4 h，然后每孔加入20% SDS溶液100μL，37℃孵育24 h，用全自动酶标仪于570 nm波长测光密度值（D），每组均设18个复孔，实验重复两次以上。

1.7 蛋白质免疫印迹（Western Blot方法）
按文献［4］方法裂解细胞，改良的Lowry 法蛋白定量［7］，每孔上样30 μg总蛋白，其余步骤（电泳，转膜，上抗体，显影等）按文献［4］方法进行。

1.8 统计学分析
采用Stata 6.0统计软件分析处理数据，各组数据以均数±标准差（ˉx ±s）表示。

各组间MTT结果进行单因数方差分析。

蛋白质印迹结果经过重复三次以上，用凝胶图像分析仪拍摄照片后，用四星图像处理系统测定各组蛋白间的特异性蛋白表达量与内参表达量（bystin以β-actin为内参）的比值，结果用单因数方差分析来比较各组之间的差异显著性。

2 结果
2.1 不同培养纯化方法星形胶质细胞的形态学观察
倒置显微镜镜下观察:（1）“原代培养”20 d，可见大量的纤维性星形胶质细胞突触交织成网，生长在铺底的原浆性星形胶质细胞之上，杂有少量的少突与小胶质细胞;（2）
“一次振荡纯化”，瓶底可见原浆性星形胶质细胞铺底，间或可见少量纤维性星形胶质细胞;（3）“二次振荡纯化”，瓶底只见有原浆性星形胶质细胞铺底，呈均一的“铺路石”样外观;（4）“传代纯化”，瓶底见纤维性星形胶质细胞生长于原浆性星形胶质细胞之上，未见少突及小胶质细胞（照片结果未显示）。

2.2 不同纯化方法的星形胶质细胞GFAP免疫细胞化学观察
GFAP是星形胶质细胞骨架蛋白，可作为其特异性标记物［2］;GFAP免疫荧光阳性者呈绿色荧光，即为星形胶质细胞。

比较四种纯化方法获取的星形胶质细胞，结果显示: “原代培养”20 d，记数比例为75%～80%，绿色荧光较暗，纤维性与原浆性星形胶质细胞都可见（图1A）;“传代纯化”，星形胶质细胞的形态同“原代培养”20 d，几乎不见不发绿色荧光的细胞，记数比例为99%以上（图1B）;“一次振荡纯化”（图1C）或“二次振荡纯化”（图1D），可见星形胶质细胞GFAP绿色荧光明亮，占满整个视野，发荧光的主要为铺底的原浆性星形胶质细胞，以“二次振荡纯化”更为明显，记数比例为97%左右。

2.3 不同纯化培养方法的星形胶质细胞Bystin表达量比较
Bystin是一种新发现的反应性星形胶质细胞灵敏的蛋白［4］。

用Western-blot法检测星形胶质细胞的bystin表达量，bystin在原代培养20 d没有表达，传3代后有少量表达，振荡纯化后表达量明显增多，以振荡二次最多（图2A）。

以β-actin为内参，三次独立的实验结果经凝胶图像分析系统进行灰度扫描，统计结果见图2B。

2.4 不同纯化培养方法的星形胶质细胞模拟缺血后细胞活性比较
分别将上述四种方法纯化的星形胶质细胞进行模拟缺血实验并检测细胞活性。

“原代培养”20 d经缺血6 h细胞活性即显著下降（P <0.05）; “一次振荡纯化”在缺血24 h细胞活性明显下降（P<0.01）; 而“二次振荡纯化”缺血直至48 h细胞活性才开始出现明显下降（P <0.05）; “传代培养”的细胞在缺血24 h细胞活性明显下降（P<0.001）（图3）。

不同培养方法的星形胶质细胞对缺血耐受能力依次为:二次振荡纯化>一次振荡纯化、传代培养>原代培养。

而只有“传代培养”的星形胶质细胞在短时间0.5 h，3 h缺血后出现有统计学意义的活性增高变化（P<0.01），提示0.5 h，3 h缺血诱导反应性星形胶质细胞产生。

3 讨论
反应性星形胶质细胞及星形胶质细胞与神经元的关系一直以来都是神经科学界关注的热门课题［1-4］，体外分离纯化星形胶质细胞是研究星形胶质细胞功能的基本方法，怎样获取高纯度的星形胶质细胞，并且使其在正常离体培养过程中不被诱导为反应性星形胶质细胞，是研究其在脑内功能的前提。

培养星形胶质细胞最常见的细胞污染为:（1）成纤维细胞:应选用新生小鼠，出生不超过3 d，否则脑中成纤维细胞比例将会增加;取材时脑膜一定要
去除干净;反复传代预贴壁是一种有效的去除成纤维细胞的方法。

（2）小胶质细胞:小胶质细胞黏附能力较强，只有通过反复传代预贴壁才能有效除去。

（3）神经元，少突胶质细胞，神经前体细胞，血细胞等:这些细胞因其增殖速度远小于星形胶质细胞，可以通过延长培养
时间及反复传代除去。

本研究根据国内外常用的四种获取星形胶质细胞的方法，比较细胞的纯度及在体外模拟缺血过程中的变化，结果发现:（1）“原代培养”的方法纯度较低，小于90%，有文献报道最主要污染的细胞为贴附能力很强的成纤维细胞与小胶质细胞［8］，只有通过反复的传代和预贴壁才能有效除去。

另外，原代培养的星形胶质细胞受刺激后增高的活性还可能受其他细胞活性的下降而不能灵敏检测出，故不宜采用;（2）“传代纯化”的方法，能够得到较为纯化的星形胶质细胞，传三代后的星形胶质细胞纯度可达99%以上，体外模拟缺血0.5，3，24，48 h，星形胶质细胞经历了从活性增高到活性逐渐降低直至细胞大量死亡的阶段，其活性增高提示星形胶质细胞被诱导生成反应性星形胶质细胞;（3）用“一次振荡”或“二次振荡”纯化获得的星形胶质细胞其反应性标志物bystin的表达量大量增加，且GFAP免疫荧光亮度增高，提示细胞已经处于“活化”阶段，可能比其他方法获取的星形胶质细胞更耐受缺血损伤。

综上，用“传代纯化”获取星形胶质细胞能有效去除其他细胞的污染，达到99%以上的纯度，有利于在离体的缺血研究中观察星形胶质细胞的变化研究其在脑中的功能。

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［基金项目］江苏省高校自然科学研究计划基金资助项目（04KJB310113）;南通市社会发展科技计划资助项目（S5041）
［作者简介］杜方（1979-），男，江苏南通人，助教，硕士。

朱俐（联系人），博士，硕士生导师，副教授，主要从事神经元的损伤与保护研究，E-mail，zhulizhou@。