基因芯片技术及其应用

基因芯片技术及其应用

郑敏

（临沂大学生命科学学院，山东临沂276000）

摘要基因芯片(DNA芯片,微阵列)是20世纪后期在杂交理论基础上发展起来的又一个分子生物学技术.将大量的核苷酸探针以点阵列方式排列于特定的固相支持物上,与放射性或荧光标记的样品靶DNA杂交,通过激光共聚焦等技术来分析靶DNA的存在和量的方法.基因芯片技术已基本实现了自动化,应用于功能基因研究、杂交测序、药物筛选诊断、基因表达、基因多态性和突变检测等,在生物学、医学、制药学、环境保护学和农林业等领域上都有极为广阔的应用前景。

.关键词基因芯片；微阵列；分子生物学；基因表达

基因芯片（genechip）是生物芯片（biochip）的一种，又称DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array），是20世纪90年代初随着人类基因组计划的发展而兴起的技术。基因芯片是按预先设计的阵列方式，把大量核酸片段固定在载体基片上，组成密集的按序排列的探针集群，通过与标记样品核酸杂交，检测其杂交信号，从而达到判断靶核酸的有无或数量的目的[1].基因芯片技术室当今生命科学领域集微电子学、生物学、化学、计算机科学于一体的高度交叉的一项尖端应用型新技术，现已成为国际上的前沿和热点[2]。现将基因芯片技术及其应用作一综述。

1基因芯片技术的产生和发展

21 世纪将是生命科学的世纪, 基因芯片技术是近年产生的一项生物高新技术, 它将像计算机一样成为21 世纪即将来临的又一次新兴革命的奠基石[]。基因芯片技术的产生与发展与人类基因组计划(Human Genome Project, HGP) 的研究密不可分[5]。人类基因组的大量信息需要有一种快速、敏感、平行检测的技术,随着越来越多的基因被解码, 基因的功能研究成为迫切需要解决的课题。在这一背景下, 以基因芯片技术为主体的生物芯片诞生了, 它被誉为是20 世纪90 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。基因芯片技术充分结合并灵活运用了寡核苷酸合成、固相合成、PCR 技术、探针标记、分子杂交、大规模集成电路制造技术、荧光显微检测、生物传感器及计算机控制和图像处理等多种技术, 体现了生物技术与其他学科相结合的巨大潜力。

基因芯片技术的理论基础是核酸杂交理论, Southern 印迹可以看作是生物芯片的雏形; 其后, 人们又发明了一个以膜片为介质基础的克隆库扫描技术, 引入了克隆与杂交型号相对应的概念, 在此基础上, 分格筛选技术得到了应用; 1989 年Ed Southern提出了利用在玻片表面固定的核苷酸探针进行基因序列测定的实验设计; 而真正使基因芯片技术发展并实用化的, 是得益于非孔固相支持介质的使用和高密度原位合成核苷酸两项技术的发明, 从而推进了基因芯片产品的商业化。在美国硅谷, 1991 年Affymax 公司开始了生物芯片的研制, 1992 年从Affymax 派生出来的世界上第一家专门生产生物芯片的公司Affymetrix 宣告成立。Forder( 现任Affymetrix 总裁) 及其同事在20 世纪90 年代初发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法, 在此基础上于1993 年设计了一种寡核苷酸生物芯片, 1996年制造出了第一块商业化的基因芯片。1994 年在美国能源部防御研究计划署、俄国科学院和俄国人类基因组计划 1 000 多万美元的资助下研制出了一种生物芯片, 用于检测β- 地中海贫血病人血样的基因突变。1998 年美国的纳米基因公司(Nanogen) 利用生物芯片在世界上构建了首例缩微芯片实验室, 该成果被美国期刊选入1998 年世界10 大科技突破之中。

最近几年, 国际上掀起了基因芯片设计热潮, 使基因芯片技术得到不断完善和发展, 出现了多种芯片技术。最初的芯片主要目标是用于DNA 序列的测定、基因表达图谱鉴定及基因突变体的监测和分析, 因此称为基因芯片。但目前这一技术已扩展到非核酸领域, 如已出现了蛋白质芯片分析技术、Biacore 技术和丝网印刷技术等。在这一发展趋势下, 芯片技术现多被称为生物芯片技术。根据芯片上固定的探针的不同, 可将生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等; 根据原理的不同, 可以分为元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片; 根据所进行的反应过程, 可将生物芯片分为生物样品的制备芯片、PCR 芯片、毛细管电泳芯片及PCR 毛细管电泳芯片等[6-9]。

2基因芯片的原理

基因芯片是利用核酸杂交原理来检测未知分子的.其基本原理是首先将一定规模的核酸片段(cDNA、EST或寡聚核苷酸)作为识别分子,按预先设置的排列固定于一种特定的固相支持载体(纤维素、硝酸纤维素、尼龙、硅片、金片及载玻片等)的表面,利用基因的碱基配对原理和印迹杂交技术等,与来自不同细胞、组织或整个器官的mRNA反转录生成的第一链的探针杂

交,通过特殊的检测系统来分析各种生物分子存在的量的一种技术.基因芯片具有可同时并行分析成千上万种生物分子的优点,并有可自动化、微型化的特点.非常适合于基因诊断和表达分析等.

3基因芯片技术

基因芯片技术可分解为DNA阵列的构建和印制、探针靶的制备、杂交和检测、数据收集与分析4个主要部分.

DNA阵列的构建和印制

根据芯片种类的应用目的的不同,芯片核酸阵列的构建方式也不相同.首先是根据研究目的选用合适的寡核苷酸、cDNA片段或特定的功能基因等,按统计方式事先构建成点阵列.然后,将所需用的核酸片段就位合成于芯片上,或以大致相当的浓度,变性后采用手工或机械的方法,按一定的排列方式点样在特定的固相支持物上,前者称为原位合成,后者可有压电打印和直接点样两种方法.

靶样品的准备

靶样品就是DNA样品,主要来源是从生物细胞中提取mRNA后经转录成cDNA,通常采用常规的基因分离、反转录、扩增的标记等.为了获得杂交信号,在扩增过中加同位素或化学荧光进行标记.同位素常用P32/P33/S35.使用Cy3-dUTP、Cy5-dUTP等荧光标记,没有同位素的放射危险性,通过激光共聚焦扫描仪器寻址测读,具有很高的分辨能力、极高的灵敏度和定位功能,是目前广泛用于芯片杂交结果判读的标记方法.荧光标记染料已开发出了数10种.

杂交和检测

杂交条件的选择与研究目的有关.如进行多态性分析或基因测序时杂交要求比较严谨;表达检测时则需要较长的杂交时间,较高的样品浓度及较低的杂交温度;突变检测主要是鉴别单碱基的错配,需时较短,但杂交严谨度要求更高.通常探针靶样品与芯片进行杂交12～18 h.探针质量对杂交结果有很大影响,经纯化的探针与芯片杂交结果的信噪比低,阳性信号比较强.杂交后要进行严谨漂洗程序.检测主要是将用于标记的放射性或荧光标记等,通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描来检测杂交信号的强弱和分布.

数据收集和分析

将经荧光或激光共聚焦扫描得到的图像输入计算机,按不同的研究目的,用专门软件对杂交