总丹参酮不同纯化工艺的比较
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参考文献: [ 1 ] 中国药典[S ]. 一部. 2005. [ 2 ] Geng F, W ang X J. P resen t situation of study on 52hyd rox2
ym ethyl222fu rfu ral [J ]. 世界科学技术—— 中医药现代化, 2005, 7 (6) : 52256.
本实验建立了在同一高效液相色谱条件下测定 山茱萸中没食子酸、52羟甲基糠醛、莫诺苷和马钱素 峰的分析方法, 这为进一步研究山茱萸炮制前后指 纹图谱奠定了基础, 也为制定山茱萸炮制工艺标准、 探讨其炮制机制提供了依据。
目前普遍认为 52羟甲基糠醛有一定的毒副作
用, 但近几年来研究表明它还具有抗氧化、改善血液 流变学等对人体有利的作用[2]。 本实验室的研究发
变化率 %
250 0109 0129 222
1192 1182
1 200 0124 0184 250
3131 2197
- 2717 1188 1142 - 2415
1141 1186
- 919 1145 1128 - 1117
1120 1103
3 讨论 52羟甲基糠醛主要是由己糖经加热分解产生,
Ξ 收 稿 日期: 2008204207 基金项目: 上海市科委中药现代化专项项目 (05D Z19701) 作者简介: 吴婉莹 (1973—) , 女, 黑龙江省哈尔滨市人, 副研究员, 博士, 从事新药的研究与开发以及中药制剂及药代动力学的研究, 在 该领域已发表论文 10 余篇。T el: (021) 50805522- 2208 Fax: (021) 50272789 E2m ail: w uw anying902@ yahoo. com. cn
69122 70147 71131 73170
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4187 4108 2153 3111
根据直观分析可知各因素对总丹参酮提取率的
影 响 次 序 为: A > B > C, 因 此 确 定 最 佳 工 艺 为 A 1B 2C2。按此最佳工艺进行3 组验证试验, 结果总丹
中草药 Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs 第 39 卷第 12 期 2008 年 12 月
丹 参 为 唇 形 科 植 物 丹 参 S a lv ia m iltiorrh iz a B unge 的干燥根及根茎, 其活性成分为水溶性酚酸 类成分和脂溶性丹参酮类成分, 其中脂溶性成分主 要有丹参酮 IIA、异丹参酮、隐丹参酮等[1]。丹参中脂
溶性成分提取工艺已有相关研究报道[2, 3], 但对于适 于生产的获取高质量分数的丹参酮的研究报道较 少。 根据丹参酮的性质, 本实验采用 95% 乙醇提取 后, 分别考察了不同的纯化工艺, 并以总丹参酮、丹
广泛存在于含有糖类物质的植物和食品中, 一般在 炮制或加热后其量会增加[2]。 本实验发现山茱萸酒 蒸品中 52羟甲基糠醛的量较生品中明显增加, 这证 实了蒸制能增加 52羟甲基糠醛的量; 另外, 还发现生 品水煎煮提取物中 52羟甲基糠醛的量也较甲醇超声 提取物中的高出约 3 倍, 而制品则差别不大, 这也证 实了加热对 52羟甲基糠醛的量确有很大的影响。
2144
转移率 %
77172 93171
21412 水沉工艺正交试验考察: 采用正交试验法考 察浓缩液的相对密度、加水倍量、静置时间的影响, 因素水平见表2。取450 g 药材按最佳工艺提取的提 取液, 分成 9 份, 分别浓缩至一定体积, 加入不同倍 量的水, 搅拌, 冷藏 (4 ℃) 静置数小时, 离心, 弃去上 清液, 沉淀用95% 乙醇溶解, 定容, 测定, 结果见表3。
试验号 A
B
C
D 总丹参酮转移率 %
1
1
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2
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73162 71190 73184 70159
74109 74156 71179 72164
总丹参酮不同纯化工艺的比较
吴婉莹, 杨 洲, 侯晋军, 果德安 Ξ
(中国科学院上海生命科学研究院药物研究所, 上海 201203)
摘 要: 目的 比较总丹参酮不同的纯化工艺, 以期寻找到一种有效部位质量分数大于 50% , 方便可行, 适于大生 产的提取工艺。 方法 以总丹参酮和丹参酮 A 的质量分数作为考察指标, 对水沉和大孔树脂纯化工艺进行考察。 结果 水沉后上大孔树脂再纯化及直接上大孔树脂纯化所得总丹参酮质量分数与直接醇提水沉所得结果没有显 著性差异。 结论 采用醇提水沉即可得到符合要求的总丹参酮。 关键词: 丹参; 总丹参酮; 醇提水沉; 大孔吸附树脂; 纯化 中图分类号: R 28611 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670 (2008) 12- 1815- 04
现山茱萸二氯甲烷部位具有特异性体液免疫增强作
用, 经分离分析得知其主要成分为52羟甲基糠醛。此 外, 药理实验还表明 52羟甲基糠醛对小鼠急性肝损 伤 具有保护作用, 对 H 2O 2 所致血管内皮细胞 SOD 活力减低有逆转作用, 可保护血管内皮细胞。 因此, 52羟甲基糠醛可以作为山茱萸的一个重要指标活性 成分, 这为制定山茱萸炮制工艺标准, 研究山茱萸炮 制机制提供了新的思路。
表 1 水沉温度对结果的影响 Table 1 Effects of tem pera ture on results
of wa ter prec ip ita tion
水沉温度
水沉前 25 ℃ 4℃
总丹参酮 出膏率 %
得量 m g 质量分数%
590148
458192
39156
2132
553133
45136
紫外分光光度计。
丹参产于山东平邑, 为唇形科植物丹参S. m il2 tiorrh iz a B unge 的干燥根及根茎, 经北京大学医学 部 天 然 药 物 学 系 韩 健 鉴 定, 其 中 含 丹 参 酮 A 0143% , 含总丹参酮 1171%。 丹参酮 A 对照品 (中 国 药品生物制品检定所, 批号 1107662200417) , X 25 型大孔吸附树脂 (南开大学化工厂) , 甲醇为色谱纯, 其余所用试剂均为分析纯。
21411 水沉温度的考察: 将 50 g 药材乙醇提取液 浓缩至 20 mL , 加入 6 倍量的水, 搅拌, 分别室温 (25 ℃) 和冷藏 (4 ℃) 静置 24 h, 离心, 弃去上清液, 沉淀 用 95% 乙醇溶解, 定容, 测定, 结果见表 1。 冷藏 (4 ℃) 静置时, 总丹参酮得量和质量分数明显好于室温 (25 ℃) 静置, 故水沉时采用冷藏 (4 ℃) 的方法。
表 2 水沉工艺的因素水平 Table 2 Factors and levels of wa ter prec ip ita tion
水平
A 相对密度
因 素 B 加水倍量
C 静置时间 h
1
0185
2
6
2
01903Βιβλιοθήκη 1231100
4
24
表 3 水沉正交试验结果 Table 3 Results of orthogona l test w ith wa ter prec ip ita tion
山茱萸
没食子酸 %
生品 甲醇提取
制品
0108 0128
R SD % 52羟甲基糠醛 % R SD %
1185
0106
3106
1179
0178
3108
莫诺苷 % 1191 1138
R SD % 1157 1145
马钱素 % 1141 1127
R SD % 1123 0179
变化率 % 生品
水煎 制品
表 5 大孔树脂纯化条件正交试验结果 Table 5 Pur ity results of orthogona l test
w ith macroporous resin s
试验号 A
B
C
D 总丹参酮转移率 %
1
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1
表 4 大孔吸附树脂纯化条件的因素与水平 Table 4 Factors and levels of pur ity cond ition s
of macroporous resin s
水平
1 2 3
因素
A 生药材: 干树脂 B 干膏: 湿树脂
3∶1
1∶3
2∶1
1∶5
1∶1
1∶7
C 径高比 1∶3 1∶5 1∶7
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中草药 Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs 第 39 卷第 12 期 2008 年 12 月
参 酮 A 为考察指标[4], 制备了质量分数达 50% 以 上的总丹参酮, 为丹参脂溶性有效部位的进一步开 发提供参考。
1 仪器与试药 A g ilen t 1100 高效液相色谱仪, 岛津U V —2401
·1817·
参酮的质量分数在 55% 左右, 确证该工艺可以提取 纯化得到符合标准的有效部位。
215 大孔树脂工艺考察: 大孔树脂是目前比较常用 的有效部位纯化方法, 丹参醇提物因为水溶性较差, 所以采用拌样法上样, 对上样量、拌样量、径高比进 行正交试验考察, 因素水平见表4。取450 g 药材按最 佳工艺提取的提取液, 减压浓缩, 真空干燥, 得干膏。 取一定量干膏与X 25 型湿树脂拌样, 上柱, 收集80% 乙醇洗脱液, 定容, 测定, 结果见表 5。方差分析见表 6。
41136
6
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3
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2
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中草药 Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs 第 39 卷第 12 期 2008 年 12 月
·1815·
表 1 山茱萸炮制前后有效成分的比较 (n= 3) Table 1 Quan tita tive ana lys is of active com pos ition s in crude and processed F ructus Corn is (n= 3)
2 方法与结果 211 总丹参酮的测定[4]: 采用紫外分光光度法。 21111 对照品溶液的制备: 取丹参酮 A 对照品适 量, 精 密 称 定, 加 95% 乙 醇 稀 释 成 含 丹 参 酮 A 014 m g mL 的溶液, 摇匀, 即得。 21112 供试品溶液的制备: 按比例取样品适量, 加 95% 乙醇定容到 5 mL , 摇匀, 即得。 21113 标准曲线的建立: 取丹参酮 A 对照品适 量, 精密称定 2103 m g, 置于 5 mL 量瓶中, 加 95% 乙 醇至刻度。分别精密移取40、55、70、85、100、115 ΛL 置5 mL 量瓶中, 在270 nm 下测定吸光度值。以质量 浓 度对吸光度进行拟合, 得到标准曲线方程A = 01071 8 C + 01051 6, R 2= 01999 9。 21114 精密度试验: 吸取供试品溶液, 分别在 1 日 内重复测定 3 次, 连续 3 日内重复测定 3 次, 以总丹 参酮质量分数计算得日内 R SD 值为 0175% , 日间 R SD 值为 1102%。 21115 稳定性试验: 吸取供试品溶液, 分别在 0、2、 4、6、8 h 测定总丹参酮的吸光度值, 计算得吸光度 值的R SD 值为 1101%。 21116 回收率试验: 分别取供试品溶液, 精密加入丹 参酮 A 对照品适量, 制备供试品溶液, 依法测定, 计 算, 平均回收率为 98153% , R SD 为 1107% (n= 9)。 212 丹参酮 A 的H PL C 法测定 : 参考《中国药典》 2005 年版一部丹参项下的高效液相色谱法测定。 213 纯化工艺的研究: 在前期的试验中, 进行了醇 提工艺的研究, 得到的提取物中总丹参酮的质量分 数约为 20% , 丹参酮 A 的质量分数约为 5% [5]。 为 了能够得到总丹参酮质量分数在50% 以上的丹参脂 溶性有效部位, 实验进行了纯化工艺的研究与探讨。 214 水沉工艺考察
ym ethyl222fu rfu ral [J ]. 世界科学技术—— 中医药现代化, 2005, 7 (6) : 52256.
本实验建立了在同一高效液相色谱条件下测定 山茱萸中没食子酸、52羟甲基糠醛、莫诺苷和马钱素 峰的分析方法, 这为进一步研究山茱萸炮制前后指 纹图谱奠定了基础, 也为制定山茱萸炮制工艺标准、 探讨其炮制机制提供了依据。
目前普遍认为 52羟甲基糠醛有一定的毒副作
用, 但近几年来研究表明它还具有抗氧化、改善血液 流变学等对人体有利的作用[2]。 本实验室的研究发
变化率 %
250 0109 0129 222
1192 1182
1 200 0124 0184 250
3131 2197
- 2717 1188 1142 - 2415
1141 1186
- 919 1145 1128 - 1117
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3 讨论 52羟甲基糠醛主要是由己糖经加热分解产生,
Ξ 收 稿 日期: 2008204207 基金项目: 上海市科委中药现代化专项项目 (05D Z19701) 作者简介: 吴婉莹 (1973—) , 女, 黑龙江省哈尔滨市人, 副研究员, 博士, 从事新药的研究与开发以及中药制剂及药代动力学的研究, 在 该领域已发表论文 10 余篇。T el: (021) 50805522- 2208 Fax: (021) 50272789 E2m ail: w uw anying902@ yahoo. com. cn
69122 70147 71131 73170
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4187 4108 2153 3111
根据直观分析可知各因素对总丹参酮提取率的
影 响 次 序 为: A > B > C, 因 此 确 定 最 佳 工 艺 为 A 1B 2C2。按此最佳工艺进行3 组验证试验, 结果总丹
中草药 Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs 第 39 卷第 12 期 2008 年 12 月
丹 参 为 唇 形 科 植 物 丹 参 S a lv ia m iltiorrh iz a B unge 的干燥根及根茎, 其活性成分为水溶性酚酸 类成分和脂溶性丹参酮类成分, 其中脂溶性成分主 要有丹参酮 IIA、异丹参酮、隐丹参酮等[1]。丹参中脂
溶性成分提取工艺已有相关研究报道[2, 3], 但对于适 于生产的获取高质量分数的丹参酮的研究报道较 少。 根据丹参酮的性质, 本实验采用 95% 乙醇提取 后, 分别考察了不同的纯化工艺, 并以总丹参酮、丹
广泛存在于含有糖类物质的植物和食品中, 一般在 炮制或加热后其量会增加[2]。 本实验发现山茱萸酒 蒸品中 52羟甲基糠醛的量较生品中明显增加, 这证 实了蒸制能增加 52羟甲基糠醛的量; 另外, 还发现生 品水煎煮提取物中 52羟甲基糠醛的量也较甲醇超声 提取物中的高出约 3 倍, 而制品则差别不大, 这也证 实了加热对 52羟甲基糠醛的量确有很大的影响。
2144
转移率 %
77172 93171
21412 水沉工艺正交试验考察: 采用正交试验法考 察浓缩液的相对密度、加水倍量、静置时间的影响, 因素水平见表2。取450 g 药材按最佳工艺提取的提 取液, 分成 9 份, 分别浓缩至一定体积, 加入不同倍 量的水, 搅拌, 冷藏 (4 ℃) 静置数小时, 离心, 弃去上 清液, 沉淀用95% 乙醇溶解, 定容, 测定, 结果见表3。
试验号 A
B
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73162 71190 73184 70159
74109 74156 71179 72164
总丹参酮不同纯化工艺的比较
吴婉莹, 杨 洲, 侯晋军, 果德安 Ξ
(中国科学院上海生命科学研究院药物研究所, 上海 201203)
摘 要: 目的 比较总丹参酮不同的纯化工艺, 以期寻找到一种有效部位质量分数大于 50% , 方便可行, 适于大生 产的提取工艺。 方法 以总丹参酮和丹参酮 A 的质量分数作为考察指标, 对水沉和大孔树脂纯化工艺进行考察。 结果 水沉后上大孔树脂再纯化及直接上大孔树脂纯化所得总丹参酮质量分数与直接醇提水沉所得结果没有显 著性差异。 结论 采用醇提水沉即可得到符合要求的总丹参酮。 关键词: 丹参; 总丹参酮; 醇提水沉; 大孔吸附树脂; 纯化 中图分类号: R 28611 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2670 (2008) 12- 1815- 04
现山茱萸二氯甲烷部位具有特异性体液免疫增强作
用, 经分离分析得知其主要成分为52羟甲基糠醛。此 外, 药理实验还表明 52羟甲基糠醛对小鼠急性肝损 伤 具有保护作用, 对 H 2O 2 所致血管内皮细胞 SOD 活力减低有逆转作用, 可保护血管内皮细胞。 因此, 52羟甲基糠醛可以作为山茱萸的一个重要指标活性 成分, 这为制定山茱萸炮制工艺标准, 研究山茱萸炮 制机制提供了新的思路。
表 1 水沉温度对结果的影响 Table 1 Effects of tem pera ture on results
of wa ter prec ip ita tion
水沉温度
水沉前 25 ℃ 4℃
总丹参酮 出膏率 %
得量 m g 质量分数%
590148
458192
39156
2132
553133
45136
紫外分光光度计。
丹参产于山东平邑, 为唇形科植物丹参S. m il2 tiorrh iz a B unge 的干燥根及根茎, 经北京大学医学 部 天 然 药 物 学 系 韩 健 鉴 定, 其 中 含 丹 参 酮 A 0143% , 含总丹参酮 1171%。 丹参酮 A 对照品 (中 国 药品生物制品检定所, 批号 1107662200417) , X 25 型大孔吸附树脂 (南开大学化工厂) , 甲醇为色谱纯, 其余所用试剂均为分析纯。
21411 水沉温度的考察: 将 50 g 药材乙醇提取液 浓缩至 20 mL , 加入 6 倍量的水, 搅拌, 分别室温 (25 ℃) 和冷藏 (4 ℃) 静置 24 h, 离心, 弃去上清液, 沉淀 用 95% 乙醇溶解, 定容, 测定, 结果见表 1。 冷藏 (4 ℃) 静置时, 总丹参酮得量和质量分数明显好于室温 (25 ℃) 静置, 故水沉时采用冷藏 (4 ℃) 的方法。
表 2 水沉工艺的因素水平 Table 2 Factors and levels of wa ter prec ip ita tion
水平
A 相对密度
因 素 B 加水倍量
C 静置时间 h
1
0185
2
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01903Βιβλιοθήκη 1231100
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表 3 水沉正交试验结果 Table 3 Results of orthogona l test w ith wa ter prec ip ita tion
山茱萸
没食子酸 %
生品 甲醇提取
制品
0108 0128
R SD % 52羟甲基糠醛 % R SD %
1185
0106
3106
1179
0178
3108
莫诺苷 % 1191 1138
R SD % 1157 1145
马钱素 % 1141 1127
R SD % 1123 0179
变化率 % 生品
水煎 制品
表 5 大孔树脂纯化条件正交试验结果 Table 5 Pur ity results of orthogona l test
w ith macroporous resin s
试验号 A
B
C
D 总丹参酮转移率 %
1
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5
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1
表 4 大孔吸附树脂纯化条件的因素与水平 Table 4 Factors and levels of pur ity cond ition s
of macroporous resin s
水平
1 2 3
因素
A 生药材: 干树脂 B 干膏: 湿树脂
3∶1
1∶3
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1∶5
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C 径高比 1∶3 1∶5 1∶7
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中草药 Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs 第 39 卷第 12 期 2008 年 12 月
参 酮 A 为考察指标[4], 制备了质量分数达 50% 以 上的总丹参酮, 为丹参脂溶性有效部位的进一步开 发提供参考。
1 仪器与试药 A g ilen t 1100 高效液相色谱仪, 岛津U V —2401
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参酮的质量分数在 55% 左右, 确证该工艺可以提取 纯化得到符合标准的有效部位。
215 大孔树脂工艺考察: 大孔树脂是目前比较常用 的有效部位纯化方法, 丹参醇提物因为水溶性较差, 所以采用拌样法上样, 对上样量、拌样量、径高比进 行正交试验考察, 因素水平见表4。取450 g 药材按最 佳工艺提取的提取液, 减压浓缩, 真空干燥, 得干膏。 取一定量干膏与X 25 型湿树脂拌样, 上柱, 收集80% 乙醇洗脱液, 定容, 测定, 结果见表 5。方差分析见表 6。
41136
6
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中草药 Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs 第 39 卷第 12 期 2008 年 12 月
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表 1 山茱萸炮制前后有效成分的比较 (n= 3) Table 1 Quan tita tive ana lys is of active com pos ition s in crude and processed F ructus Corn is (n= 3)
2 方法与结果 211 总丹参酮的测定[4]: 采用紫外分光光度法。 21111 对照品溶液的制备: 取丹参酮 A 对照品适 量, 精 密 称 定, 加 95% 乙 醇 稀 释 成 含 丹 参 酮 A 014 m g mL 的溶液, 摇匀, 即得。 21112 供试品溶液的制备: 按比例取样品适量, 加 95% 乙醇定容到 5 mL , 摇匀, 即得。 21113 标准曲线的建立: 取丹参酮 A 对照品适 量, 精密称定 2103 m g, 置于 5 mL 量瓶中, 加 95% 乙 醇至刻度。分别精密移取40、55、70、85、100、115 ΛL 置5 mL 量瓶中, 在270 nm 下测定吸光度值。以质量 浓 度对吸光度进行拟合, 得到标准曲线方程A = 01071 8 C + 01051 6, R 2= 01999 9。 21114 精密度试验: 吸取供试品溶液, 分别在 1 日 内重复测定 3 次, 连续 3 日内重复测定 3 次, 以总丹 参酮质量分数计算得日内 R SD 值为 0175% , 日间 R SD 值为 1102%。 21115 稳定性试验: 吸取供试品溶液, 分别在 0、2、 4、6、8 h 测定总丹参酮的吸光度值, 计算得吸光度 值的R SD 值为 1101%。 21116 回收率试验: 分别取供试品溶液, 精密加入丹 参酮 A 对照品适量, 制备供试品溶液, 依法测定, 计 算, 平均回收率为 98153% , R SD 为 1107% (n= 9)。 212 丹参酮 A 的H PL C 法测定 : 参考《中国药典》 2005 年版一部丹参项下的高效液相色谱法测定。 213 纯化工艺的研究: 在前期的试验中, 进行了醇 提工艺的研究, 得到的提取物中总丹参酮的质量分 数约为 20% , 丹参酮 A 的质量分数约为 5% [5]。 为 了能够得到总丹参酮质量分数在50% 以上的丹参脂 溶性有效部位, 实验进行了纯化工艺的研究与探讨。 214 水沉工艺考察