双向电泳

优点
1.上样简单 2.解决了样品杯上样时常出现的样品 沉淀问题 3.在等电聚焦前蛋白质样品已经完全 进入胶条，可缩短聚焦时间 4.提高蛋白上样量

主动或被动上样：3种方式 方式一
方式二

方式三

搭盐桥
先让胶条吸胀1h，再覆盖2-3ml矿物油， 然后水化至少11h 。
等电聚焦程序的设置
操作步骤
上样 水化 设置等电聚焦程序，开始水化 和聚焦


上样方法：主动上样、被动上样、 样品杯上样
样品杯上样: 难以操作，人为影响大， 尽量不选择


主动上样、被动上样：样品在溶胀过程 中，被均匀吸收到整个胶条
1.含有高浓度的DNA、RNA、或其它大分子、如纤 维素 2.含白蛋白的血清样品 3.用碱性范围IPG胶条时，例如PH7-10 4.含有高浓度的糖蛋白
三、胶条平衡


作用： 蛋白质二硫键的还原及半胱氨酸残 基的烷基化 样品与SDS结合 时间： 2×（10-15）分钟 （第一步：DTT 第二步：碘乙酰胺）

IPG胶条的转移及琼脂糖封胶液的包埋 两种方法
四、第二向分离：SDS- PAGE


仪器
Mini-PROTEAN 3 System 适用于7cm IPG胶条, 1-2块胶
提供高通量的电泳平台 半导体冷却平台精确控温，10 -25℃ 提供高电压（内置10,000V高压电源）

ReadyStrip IPG Strips
5 种长度(7cm,11cm,17cm,18cm,24cm) 短 胶条电泳时间短，适用于方法优化；长胶条电 泳时间长，能予以最好的蛋白分辨率和更高的 上样量。
THE END

六、成像及软件分析

成像设备
光密度扫描仪、荧光扫描仪、同位素磷屏 扫描仪等

分析软件：PDQuest软件
对蛋白质点进行检测及计数 图像间的比较 对实验数据进行统计学分析
七、蛋白鉴定



蛋白切胶仪（ProteomeWorks spot cutter）： 切取感兴趣的蛋白质点 酶解工作站：自动地进行脱色、蛋白降 解 质谱仪/串联质谱仪：肽质量指纹分析、 序列标签鉴定或蛋白质测序
双向电泳 实验技术与方法
医学结构中心 何远
原理

第一向：等电聚焦（isoelectric focusing,IEF），根据蛋白质等电点不同 进行分离
溶液pH值 ＞蛋白质pI， 带“-” 溶液pH值 ＜ 蛋白质pI， 带“+” 溶液pH值 = 蛋白质pI， 电荷为零

第二向：SDS- PAGE
蛋白质与SDS结合成蛋白质-SDS复合物 电泳迁移率不受蛋白质原有电荷的影响， 主要取决于蛋白质分子量的大小

The Criterion Dodeca Cell 适用于11cm胶条,1-12块胶

Gel cassette

PROTEAN II Xi Cell 适用于17 cm IPG strips ，1-2块胶
五、染色
各种染色方法的特点及选择 （见讲 义） 步骤参考普通SDS-PAGE 的染色方 法
电压在设定的时间内，以上一步的最终 电压为起点线性的上升，直达到所设置最高 电压。常用于电阻大小适中的样品。(盐量一 般)
慢速升压模式（slow ramping mode）
电压上升呈二次函数，运行过程中电流 始终低于或等于极限电流。常用于高电阻的 样品/溶胀缓冲液体系。(高盐）
操作注意问题：
（1）上样方法的选择 ：主动上样、被 动上样、样品杯上样 （2）上样要充分：上样体的污染
实验流程
样品制备 第一向分离 平衡 第二向分离 染色 成像及软件分析 蛋白鉴定

一、样品制备

样品制备是双向电泳的关键之一，不 同来源的材料由于组成成分的差异， 蛋白质提取方法不尽相同。
遵循几个基本的原则( 5条)

二、第一向分离：等电聚焦

仪器

PROTEAN 等电聚焦仪是PROTEAN IEF系 统的核心部分，具有以下特点：
三种升压模式：快速 、线性 、慢速 由IPG胶条、溶胀缓冲液及样品的共同 电阻决定
快速升压模式（rapid ramping mode)
盐离子和其它离子杂质从IPG胶条中以最 快速度转移出去，可用于多种样品,对于缩短 低电阻样品的运行时间特别有用。（低盐）
线性升压模式（linear ramping mode）