PCR过程问题全解

如何防止PCR形成引物二聚体？

在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？

答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。

PCR模板大约在104-106个拷贝。

答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。

答3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；

2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；

3. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

4. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；

5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；

6. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。

7. 增加循环数可以适当降低引物二聚体；

8. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；

9. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。

10. 以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。

PCR假阴性的原因分析

PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就被深刻认识到了，同时由于造成假阳性的因素相

对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话，那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性，仍然有相当的临床适用价值。但PCR 的假阴性在检验工作中仍很严重，并且用些因素经常被人忽略，严重的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目，有什么样的诊断价值。造成PCR假阴性的原因是复杂的，也是多样的。主要有：

1.PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题（如：温控不准等）给临床带来了诸如非特异性扩增（假阳性）、扩增效率下降(假阴性）等问题.

2.离心机问题。离心机的质量或使用不正确，造成离心标本模板没有分离出来造成假阴性，窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR，在整个检验工作中都是最易被忽视的问题，只是因为在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。

离心机是常用的固液分离设备，其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速，根据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的，因此对于不同有效半径的离心机相同的转速其离心加速度是不同的，转速的调节要因离心机而异，但很遗憾，日常工作中忽视了这个问题。有效半径短的离心加速度就小，同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热，因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持怀疑态度。

3.试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来，致使扩增无法进行，这是造成假阴性的又一主要因素。

问题1：无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无

原因:

1.模板:含有抑制物，含量低

2.Buffer对样品不合适

3.引物设计不当或者发生降解

4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

对策:

1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

2.更换Buffer或调整浓度

3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物

4.降低退火温度、延长延伸时间

问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：

1.引物特异性差

2.模板或引物浓度过高

3.酶量过多

4.Mg2+浓度偏高

5.退火温度偏低

6.循环次数过多

对策：

1.重新设计引物或者使用巢式PCR

2.适当降低模板或引物浓度

3.适当减少酶量

4.降低镁离子浓度

5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法

6.减少循环次数

问题3：拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：

1.模板不纯

2.Buffer不合适

3.退火温度偏低

4.酶量过多

5.dNTP、Mg 2+浓度偏高

6.循环次数过多

对策：

1.纯化模板

2.更换Buffer

3.适当提高退火温度

4.适量用酶

5.适当降低dNTP和镁离子的浓度

6.减少循环次数

问题4：假阳性

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因：

靶序列或扩增产物

的交*污染

对策：

1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；

2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管

及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存

请问PCR引物存放时间是多少？

这要看是什么状态，要是粉末的话，在－20度可以存放好几年；要是已经把引物稀释成液体状态的话，存放时间就要短一点了，但也可以存放一年左右的时间，甚至更长。

不过这也要看你们实验室的冰箱是不是经常开启，要是是的话，存放时间就很受影响，实验室的冰箱就是经常打开，而且有时候大家找东西要找好长时间，所以引物总是用半个多月的时间，效力就下降了，PCR后的条带明显就没有以前亮了。

建议你合成引物的时候，让公司每个OD分装成一管，每次你用的时候，取一管稀释成使用浓度；或者先稀释到储存浓度，分装后要用的时候再稀释到使用浓度。另外一定要注意避免反复冻融，反复冻融会使存放时间变短的。

最简单的就是分装了,以储存浓度保存,稀释10或20微升,就可以用好些次,即可避免反复冻融还可以避免整管引物都被污染.

干粉－20度可以保存一年，稀释后－20度可以保存半年。

可以先稀释成100uM，分装成几管。然后再稀释成50uM和20uM的。每次用20uM的做PCR即可。尽量避免反复冻融。