乳品安全中的牛乳过敏

乳品安全中的牛乳过敏
Milk allergy in the dairy safety
罗曾玲陈红兵
LUO Zeng-ling CHEN Hong-bing
(南昌大学食品科学教育部重点实验室中德联合研究院,江西南昌330047) (The Key Laboratory of Food Science of MOE,Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Ministry of Education,Nachang,Jiangxi
330047,China)
摘要:牛乳过敏是婴幼儿中一种常见的食物过敏，严重危害婴幼儿健康。

对牛乳过敏的机理、牛乳中的过敏原成分、牛乳过敏原的检测、加工对牛乳过敏原的影响作了详细的介绍。

关键词:牛乳过敏；牛乳过敏原
Abstract:Milk allergy is the most food allergy in early childhood and is harmful for the growth of the children.The mechanism of milk allergy, milk allergens,the detection of milk allergens and effects of processing on milk allergens are introduced in detail.
Keywords:Milk allergy；Milk allergen dairy safety
牛乳过敏是儿童中一种常见的食物过敏，严重地影响儿童的身体健康。

它在儿童中的发生率为0.5%～7.5%[1，2]，且主要见于婴幼儿，一般是暂时性的，随着年龄的增长，会自动消失[3]。

据报道，在北欧的一些国家，牛乳过敏在2岁以下儿童中的发生率为1.9%～2.8%，而在3岁以上儿童中的发生率仅为0.3%左右[4]。

在成年人中牛乳过敏也偶有发生，但发生率极低，小于1%[5]。

乳及乳制品是儿童重要的食物蛋白来源，而牛乳过敏严重危害儿童健康，已引起了全球的广泛关注，是食品安全领域的主要研究课题之一。

1机理
牛乳过敏是由牛乳中蛋白过敏原所引发的食物不良反应，与非过敏性食物不——————
基金项目：国家自然科学基金项目（30560096）
作者简介：罗曾玲(1981-)，女，南昌大学中德联合研究院在读研究生。

E-mail:luozling269@
通讯作者：陈红兵
收稿日期：2006-02-04
良反应(如乳糖不耐症)不同，它是由免疫机制调节的。

牛乳过敏主要是IgE 介导的变态反应，也有非IgE 介导的[6]。

症状主要表现为一些皮肤、呼吸道、胃肠道症状及全身性的症状(如过敏性昏厥等)[7]。

根据过敏反应机制可以将牛乳过敏反应分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个基本类型。

牛乳过敏可能由其中的一种或多种反应共同引发[5]。

由IgE 介导的Ⅰ型超敏反应(immediate type)是牛乳过敏中最常见的。

机体初次接触乳品过敏原时，过敏原刺激机体产生IgE，然后IgE 与肥大细胞及嗜碱性粒细胞结合，当再次受到相同过敏原刺激时，脱颗粒释放出组胺、白三烯等生物活性物质，诱发临床症状。

在牛乳过敏反应中，Ⅱ型过敏反应（cytotoxic type）是牛乳过敏反应中最不常见的。

乳过敏原激发人体产生抗体IgG、IgM、IgA，抗体直接与附着在特定细胞或组织上的牛乳过敏原结合，在补体、巨嗜细胞、单核-吞噬细胞、K 细胞的参与下造成组织损伤。

Ⅲ型过敏反应(immune complex type)是牛乳过敏反应中发生率仅次于Ⅰ型的过敏反应。

牛乳中的可溶性抗原与特异性的IgG、IgM、IgA、IgE 及补体形成免疫复合物，免疫复合物在毛细血管内沉淀，引起血管及其周围的炎症。

Ⅳ型过敏反应(delayed type)则是由T 淋巴细胞所介导的。

乳过敏原使T 细胞致敏，致敏的T 细胞再次接触相同乳品过敏原时释放出淋巴因子，活化巨噬细胞引起一系列组织反应和损伤[5,8～10]。

2牛乳中的过敏原成分
食物过敏属免疫学中的一种变态反应，，是由食物中的过敏原成分所引起。

牛乳中的主要过敏成分有酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等。

2.1酪蛋白
酪蛋白大约占牛乳总蛋白的80%，它由αs 1-、αs 2-、β-、K-酪蛋白4种组
分构成，4种酪蛋白以37%、37%、1%和13%相对恒定的比例聚合成微粒——酪蛋白胶束，悬浮于乳清中。

各种酪蛋白在胶束中的分布并不均一，形成一个疏水的中心和外周的亲水层。

其外周的亲水层中β-酪蛋白的C-端极性片段显露，其它酪蛋白的极性区及一些磷酸丝氨酸的主要磷酸化位点也被包裹在外周的亲水层，这种结构上的分布决定了酪蛋白的结合及传递特性[11]。

4种酪蛋白一级结构的氨基酸序列同源性很小，但仍有一些共同特性明显区别于其它蛋白：(1)都是磷
酸化的蛋白，分子中那些含有大量磷酸化残基的酸性肽链对蛋白的致敏性及不同酪蛋白间的交叉反应起重要作用；(2)分子通过疏水相互作用形成非刚性的“random coil”三级结构[3]，这种松散易变的三级结构，在消化的过程中极易被蛋白酶破坏，因而酪蛋白通常被认为具有弱的致敏性。

但因其在牛乳中的含量较高或含有较多的线性表位，酪蛋白仍是一种主要过敏原。

有文献报道大约65%的牛乳过敏病人对酪蛋白过敏[3]。

2.2β-乳球蛋白
β-乳球蛋白是乳清中含量最多的蛋白，在鲜牛乳中以36kDa的二聚体形式存在，其单体由162个氨基酸残基组成。

β-乳球蛋白属于Lipocalin蛋白，据报道这一类蛋白具有强的致敏性，许多的动物源性过敏原，如马的主要过敏原Equ C1、几种主要的鼠源性尿蛋白等都属于这类蛋白[12]。

Selo、Adel Patient、Heinzmann以及Jarvinen等人对β-乳球蛋白的致敏性及抗原决定簇进行了大量研究。

确认了分子具有多个抗原决定簇，其中一些是短的线性序列，一些是由大的片段构成的构象表位。

氨基酸序列(41～60)、(102～124)、(149～162)被确认为是主要的线性表位[13～16]。

2.3α-乳白蛋白
α-乳白蛋白是单体，呈球状,由123个氨基酸残基构成，分子量为14.4kDa。

α-乳白蛋白具有调节乳糖合成的生理功能，同时具有较高的钙亲和力。

α-乳白蛋白中含有大量人体必需氨基酸，必需氨基酸的含量占到总氨基酸的63.2%，是一种较为理想的营养蛋白[17]。

尽管牛乳中的α-乳白蛋白与人体中的α-乳白蛋白具有极大的同源性，它们有74%的氨基酸残基完全一致，另有6%的残基化学性质相似，但是α-乳白蛋白仍被认为是一种主要的牛乳过敏原[8]，有大约51%的牛乳过敏患者对这种蛋白过敏[5]。

牛乳中的微量蛋白，如牛血清蛋白、乳铁结合蛋白及免疫球蛋白在牛乳过敏中也起着非常重要的作用，有35%～50%的过敏病人对这些微量蛋白过敏，而且其中一些病人只对这些微量蛋白过敏[5]。

3牛乳过敏原的检测
2002年国际食品规范委员会提议对欧洲的食品标签法规进行修改，摒弃原来的25%之原则（即：食物成分在食品中的含量低于25%时，在食品标签中可以
不予标出），提议对所有的食物成分进行标示[18]。

这一提议对保护食物过敏人群非常有利，但同时也要求更可靠有效的食物过敏原检测方法来确保它的实施。

用于检测牛乳过敏原的方法有多种：免疫吸附实验（radio-allergosorbent test，RAST）、高压液相层析法（high-pressure liquid chromatography，HPLC）、SDS-PAGE电泳、酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等。

最初这些方法主要用于区别牛乳、、山羊乳、绵羊乳、检测婴儿低过敏食物、乳替代性食物中的过敏原残基，后来逐渐用于加工食品中牛乳过敏原的检测[18]。

各种检测方法的敏感率和最低检测线不同。

Anguita等用竞争性ELISA检测奶酪、绵羊乳、公山羊乳中的牛乳过敏原，当含量达0.5%～25%即可检出[19]。

Molina用SDS-PAGE及免疫印迹法联合检测大豆蛋白中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白，当含量达0.1%时即可被检出[20]。

Jonsson用生物传感器检测食物中的β-乳球蛋白，检测线小于10mg/kg[18]。

Fremont等用RAST阻隔实验检测婴儿米粉中的α-乳白蛋白，当含量达1～5mg/kg时可被检出[21]。

Negroni等用针对天然β-乳球蛋白及变性β-乳球蛋白的特异性单克隆抗体做夹心ELISA，检测线分别为0.03μ/gL和0.2μ/Gl[20]。

Mäkinen-Kiljunen和Palosuo用抗β-乳球蛋白兔血清做夹心ELISA，检测线为0.002μ/gL[22]。

近些年来也出现了许多商品化的检测试剂盒，这些试剂盒绝大部分是以竞争性ELISA实验为基础的，检测食物中的牛血清蛋白、酪蛋白、β-乳球蛋白或非特定的乳清蛋白，检测线一般在2.5～5mg/kg之间,也有一些检测酪蛋白的试剂盒，检测线低于2.5mg/kg[18]。

另外一种以β-乳球蛋白为检测目标的夹心ELISA 商品化试剂盒，检测线降至1mg/kg。

市场上已有的一种以β-乳球蛋白为检测目标的三明治ELISA试剂盒，检测线降低到了1mg/kg。

另外有一些检测酪蛋白的试剂盒检出测线也低于2.5mg/kg [18]
目前因为有关食物过敏原阈值的直接研究报道极少，加之过敏人群的个体差异性及各种食物致敏性的不同，对各种检测方法的检测线没有明确的规定，一般认为在1～100mg/kg即可[18]。

4加工对牛乳中过敏原成分的影响
4.1热处理
热处理通过破坏分子空间构象影响蛋白的致敏性，与蛋白本身性质及处理条件相关。

在牛乳的几种主要过敏原中，酪蛋白、α-乳白蛋白的热稳定性比β-乳球蛋白、牛血清蛋白强。

热处理使β-乳球蛋白、牛血清蛋白完全失活后，酪蛋白、α-乳白蛋白仍保留有40%～50%的抗原活性[23]。

牛乳煮沸2min或5min 其致敏性不变，将处理时间延长至10min,致敏性降低50%～66%[24]。

热处理也可能使一些牛乳蛋白的致敏性增强。

Maynard等在热变性的β-乳球蛋白中发现了在天然β-乳球蛋白中不存在的表位[24]，表位增加有可能导致致敏性增强。

Song 等也发现热处理破坏β-乳球蛋白β-桶结构，但是分子的免疫活性却明显增强[25]。

因热处理对不同蛋白致敏性影响不同，在用热处理来降低食物致敏性时，必须考虑过敏原本身性质。

4.2水解
水解对蛋白致敏性的影响是通过破坏分子空间结构和断裂酰胺键以减小过敏原的分子量来实现的，与水解条件及选用的酶有关。

胃蛋白酶和胰蛋白酶在pH7.5条件下，处理150min后，α-乳白蛋白、牛血清蛋白、免疫球蛋白致敏性降低了78%～100%，而在pH2、3、或4的条件下致敏性仅降低了9%～52%。

β-乳球蛋白受胃蛋白酶水解影响较小，而胰蛋白酶可以将其完全水解[26]。

一般认为水解能使蛋白的致敏性降低，但是一些蛋白在水解过程中，分子结构破坏，深藏分子内部的表位暴露，致敏性反而增强。

Haddad等发现10个对β-乳球蛋白过敏的病人，其中4个对β-乳球蛋白水解片段的过敏强于对β-乳球蛋白完整分子的过敏[27]。

Stlo等通过实验证明，在不破坏线性表位的前提下，水解断裂β-乳球蛋白分子内的二硫键，破坏分子的结构，对β-乳球蛋白免疫活性的影响很小[28]。

4.3发酵
一些乳制品的生产需要经过发酵，如酸乳的生产。

研究表明发酵也会对蛋白的致敏性产生一定的影响。

Jedrychowski等用嗜温乳杆菌和嗜热乳杆菌对灭菌乳进行发酵。

用兔血清做ELISA检测，发现β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的致敏性降低了99%，但是在皮肤实验中，这种影响不明显[29]。

发酵不仅影响蛋白的致敏性，在发酵过程中所引入的益生菌也对治疗食物过敏有作用。

5结论
牛乳过敏问题为乳品工业提出了新的课题，在此领域，国外开展了许多工作，但仍有大量的研究工作等待探索。

目前，对牛乳过敏的研究主要集中在乳过敏原的研究，探讨不同的蛋白间是否存在相似功能及共同的结构特征与它们的交叉反应相关性；通过过敏原表位的定位研究其致敏性；通过基因重组技术获得高纯度的重组抗原用于乳制品中过敏原成分检测等；过敏原阈值的研究，了解牛乳过敏原的阈值对在无过敏或低过敏食品中安全使用乳品配料非常有价值。

总之，牛乳过敏的研究是值得探索的食品安全问题之一。

参考文献
1Host A,Halkebn S.A prospective study of cow milk allergy in Danish infants during the first3years of life:clinical course in reaction to clinical and immunological type of hypersensitivity reaction[J]. Allergy,1990(45):587～596.
2Host A,Bahana SL.Cow’s milk allergy.In Frieri M,Kettlehut B.editors Food Hypersensitivity and Adverse Reactions:A practical Guide for Diagnosis and Management[M].New York:Marcel Dekker,1999:99～111.
3Wal J M.Cow milk protein/allergens[J].Annals of Allergy,Asthma,and Immunology,2002(89):3～10.
4Host A,Halken S A.A prospective study of cow milk allergy in Danish infants during the first3years of life clinical course in relation to clinical and immunological type of hypersensitivity reaction[J].Allergy,1990(45):587～596.
5Sami L Bahana.Cow’s milk allergy versus cow milk intolerance[J].Annals of Allergy,Asthma and Immunology,2002,12(6):56～60.
6Wal J M.Bovine milk allergenicity[J].Annals of Allergy,Asthma,and Immunology,2004(93):2～11.
7Host A.Frequency of allergy in childhood[J].Annals of Allergy,Asthma, and Immunology,2002(89):33～37.
8Leea P,Lina L and Esa-Matti L.Current perspectives on milk hypersensitivity[J].Trend in food science&technology,1999(10):229～233.
9John W S.Cow’s milk allergy:a new understanding from immunology[J]. Annals of Allergy,Asthma and Immunology,2003,6(90):81～83.
10郑武飞.医学免疫学[M].北京:人民教育出版社,1989,173～190.
11Wal J M.Bovine milk allergen city[J].Annals of Allergy,Asthma and Immunology,2004,19(93):2～11.
12Fennma O R.食品化学[M].北京:中国轻工业出版社,2003,715.
13Ball G,Stilton M J,Walsti B J et al.A major continuous epitope of β-lactoglobulin rcognization by human IgE binding[J].Clin Exp Allergy, 1994(24):758～764.
14Heizmann A,Blattmann S,Spuergin P,et al.The recgnition pattern of sequential B cell epitopes ofβ-lactoglobulin does not vary with the clinical manifestation of cow’s milk allergy[J].Int Arch Allergy Immunol,1999(120):280～286.
15Jarvinen K M,Chatchatee P,Bardina L,et al.IgE and IgG binding epitopes onα-lactalbumin.Andβ-lactoglobulin in cow’s milk allergy[J].Int Arch Allergy Immunol,2001(126):111～118.
16Maynard F,Jost R,Wal J M.Human IgE binding capacity of tryoic peptides from bovineα-lactalbumin[J].Int Arch Allergy Immunol, 1997(113):478～488.
17Farrell H M.,Jimenez-Flores J M,Bleck G T,et al.Nomenclature of the proteins of cow’milk-sixth revision[J].Journal of Dairy Science,2004,6(87):1641～1674.
18Poms R E,Klein C L,Anklam E.Methods for allergen analysis in food:a review[J].Food Additives and Contaminants,2004,1(21):1～31.
19Anguita G,Martin R,Garcia T,et al.A competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine milk in ovine and caprine milk and cheese using a monoclonal antibody against bovine beta-casei n[J].J.Food Prot.,1997,60(1):64～66.
20Molina E,Amigo L,Ramos M.Detection of bovine milk proteins in soymilk by Western blotting[J].J.Food Prot.,1998,61(12):1691～1694.
21Fremont S,Kanny G,Bieber S,et al.Identification of a masked allergen, alpha-lactalbumin,in baby-food cereal flour guaranteed free of cow's milk protein[J].Allergy,1996,51(10):749～754.
22Mäkinen-Kiljunen S,Palosuo T.A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for determination of bovine beta-lactoglobulin in infant feeding formulas and in human milk[J].Allergy,1992,47(4):347～352.
23Carrocio A,Cavataio F,Iacono G.Cross-reactivity between milk proteins of different animals[J].Clinical and Experimental Allergy, 1999（29）:1014～1016.
24Host A,Samuelsson E G.Allergic reactions to raw,pasteurized and homogenized/pasteurized cow milk:a comparison a double-blind placebo-controlled study in milk allergic children[J]. Allergy,1998(43):113～118.
25Sharma S,Kumar P,Betzel C,et al.Structure and function of proteins
involved in milk allergies[J].Journal of chromatography B, 2001(756):183～187.
26Chun Y S,Wen L C，Ming C H，et al.Epitope mapping of a monoclonal antibody specific to bovine dry milk:involvement of residues66-76of strand D in thermal denatured beta-lactoglobulin[J].J.Biol Chem.,2005,280(5):3574～3582.
27Astwood J D,Leach J N,Fuchs R L.Stability of food allergens to digestion in vitro[J].Nat Biotechnol,1996(14):1269～1273.
28Selo I,Clement G,Bernard H,et al.Allergy to Bovineβ-lactoglobulin: specificity of human IgE to tryptic peptides[J].Clin Exp Allergy,1999(29):1055～1063.
29Haddad Z H,Kalra V,Verma S.IgE antibodies to peptic and peptic-tryptic digests ofβ-lactoglobulin:signification in food hypersensitivity[J].Ann Allergy,1979(42):368～371.。