细菌与酵母表面展示技术

与传统的生物陶选技术相比，荧 光激活细胞筛选仪具有以下特色
①高富集比 ②高阳性率 ③避免“亲和效应”
基于冰核蛋白的狂犬病毒糖蛋白细 菌表面展示
• 冰核蛋白是丁香假单胞菌的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶形成， 它通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细菌表面，利于大分子蛋白的表 面呈现。 • 狂犬病毒糖蛋白是病毒与宿主细胞结合的配体，介导病毒与靶 细胞结合。而且是狂犬病毒的主要保护性抗原，能刺激机体产 生抗体，保护机体抵抗病毒感染。 • 方法： 1 冰核蛋白N末端序列的PCR扩增 2 狂犬病毒糖蛋白序列的PCR扩增 3 重组表达载体的构建 4 重组载体的表达（可以导入大肠埃希菌培养、菌体裂解） 5 蛋白表面展示的初步鉴定（结合ELISA，分光光度法鉴定重组 蛋白是否成功展示在细胞表面）
细菌表面展示系统
传统：细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面 附属结构亚单位（如菌毛、鞭毛等） 近年：冰晶核蛋白、自体运转蛋白、S2 层蛋白等 每种展示系统都有自身的缺点（如展示 蛋白大小的限制、错误定位、形成包涵 体、外膜不稳定等），因此需要开发新 的系统，以进一步优化表面展示系统。
早期研究多集中在革兰氏阴性菌。原 因是遗传背景清楚，便于控制蛋白展 示。
但是从应用上来看，革兰氏阳性菌的某 些特性更适合于表面展示。 如下表：
表面锚定 外源蛋白 展示蛋白 机制 插入数 通过膜层 细胞壁
革兰氏阴 有 性菌
革兰氏阳 有 性菌
较短的片 质膜层， 较薄 段 并与外膜 正确结合
多达几百 只需通过 较厚，坚 个 单个质膜 固易操作 层
缺点：转化率低，限制构建较大容量的 肽库；一些革兰氏阳性菌分泌大量蛋白 酶，这会给应用带来麻烦。
• 简介：源自文库
酵母表面展示系统是继噬菌体展 示技术创立以后发展起来的展示系 统。酵母的蛋白质折叠和分泌机制 与哺乳动物的细胞非常相似，对人 的蛋白质表达和展示具有优越性。 酵母细胞颗粒大，可用流式细胞仪 进行筛选和分离。目前报道的两种 酵母展示系统分别以α-凝集素作为 融合骨架。
1.目的蛋白-α-凝集素表面展示系统
前景：
表面展示技术日新月异，酵母展示系统在不断的完善和改 进，在多个领域得到广泛应用。由于其是真核细胞展示系统， 对于哺乳动物蛋白质，尤其是人的蛋白质的展示具有独特的 优越性，相信随着此技术的不断完善，在蛋白质分子的研究 方面发挥越来越重要的作用。
谢谢观赏
天然α-凝集素结合活性部位 在Aga2p的C端，因此，此处 代表了一个细胞外大分子的可 及性区域和展示固定蛋白质的 有用位点。 酵母有两种交配类型MATa 和MATa的单倍体细胞，这两 种细胞之间的相互交配融合是 通过细胞表达α-凝集素和α-凝 集素的相互作用介导的。
• 目前，酵母表面展示技术被广泛应用于蛋白质分 子的相互识别、定向进化以及新型疫苗的研制等 发面。①蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统 用于蛋白质亲和力和稳定性的定型进化已有成功 报道，最先被用于抗体的亲和力成熟;②活的口服 疫苗：在细胞表面表达的蛋白质易于接近抗体， 因此，可被免疫系统识别，即使很小的肽，当展 示在细胞表面时，也具有免疫原型。因而可通过 在酵母表面表达异质性的抗原蛋白来发展疫苗。 • 酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行筛 选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的 的突变体分离成为可能。由于酵母展示的蛋白质 是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取， 同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具 有很好的应用前景。
细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选 仪或流式细胞筛选仪，是非常有效的高通量 筛选方法。
优点： 1、 能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。 2、目前唯一能够定量检验单细胞水平和大量突变体催化活 性的方法。 3、定量分析酶活性 4、同时检测多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。 与噬菌体相比：细菌表面展示技术在疫苗应用上具有独特优 势；进行更快速更高效筛选
•
Schreuder等将来自瓜儿豆 胶的α-半乳糖苷酶的基因插入 到酿酒酵母转化酶分泌信号和 α-凝集素C端部分编码序列之间 。α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶 -α-凝集素（α-Gal-ACI）融合蛋 白，均由固有的磷酸果糖激酶 (PGK)启动子控制，并且是多拷 贝的。批量培养过程中检测了 细胞和生长介质中的酶活性， α-半乳糖苷酶被高效分泌入培 养介质，而αGal-ACI融合蛋白 主要与细胞有关。
细菌表面展示技术 酵母表面展示技术 第七组
定义：细菌表面展示技术是利用基因工程手 段将某一蛋白或短肽段（靶蛋白）与微生物 外膜蛋白（载体蛋白）以融合蛋白的形式呈 现在细胞表面。
外源蛋白与载体蛋白结合方式
C端融合 (N端锚定在外膜)
N端融合 (C端锚定在外膜) 夹心融合(有些蛋白本身具有信号肽序列 及锚定于外膜的序列，内部合适位点插 入外源蛋白)
此系统将目的蛋白作为N端，与α-凝集素C端部分融合， 目的蛋白经α-凝集素展示酵母细胞表面。α-凝集素共价连 接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨 基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的 O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发挥 作用。 • 迄今，已有多个应用α-凝集素的C端作为融合蛋白的报道。 第一个通过此系统表达的异源蛋白是α-半乳糖苷酶。 •
2.α-凝集素-目的蛋白表面展示系统
这是一种将目的蛋白作为C端与α-凝集素 Aga2p亚基的N端融合的表面展示系统。α-凝集素通过 与α-凝集素相似的连接锚定在细胞壁上。与α-凝集 素不同，α-凝集素由两个亚单位的糖蛋白组成。 • 酵母表面展示系统应用在酿酒酵母的α-凝集 素将外源蛋白质展示与细胞表面。α-凝集素由核心亚 单位(Agalp)和结合亚单位(Aga2p)两个亚单位组成， Agalp 共725个氨基酸，合成后被分泌到细胞外，与酵母细 胞壁共价连接。Aga2p通过两个二硫键与Agalp结合， 外源蛋白通过与Aga2p的C端融合可展示在酵母细胞表 面。 •
综上所述，细菌表面展示系统灵活多 样，操作简便，在多个领域显示出广 泛的应用前景，随着新的载体系统的 发展和其自身的不断完善，细菌表面 展示技术必将在实践中发挥更大的作 用。
酵母表面展示技术
原理
• 酵母细胞表面展示技 术是近年来发展较快的一种真核蛋 白表达系统，其基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白) 与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞， 利用酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵 母细胞表面。