三杆状病毒介导的腺相关病毒载体的生产1

三杆状病毒介导的腺相关病毒载体的生产1

雷求刚1，徐增辉2，钱其军1,2 *

1浙江理工大学生命科学学院，杭州(310018)

2第二军医大学东方肝胆外科医院，上海(200438)

E-mail: lqg127@

摘要：由于腺相关病毒(Adeno-associated Viruses, AAV)的非致病性及能感染多种组织类型，重组AAV载体（rAAV）在基因治疗领域备受关注。然而，如何有效生产rAAV以适应临床上对其高产量的需求一直是个较大的瓶颈。借助杆状病毒携带rAAV包装所需组分，通过感染昆虫细胞来生产rAAV是一种能够解决其产量瓶颈的生产方式。将AAV2的Rep、Cap基因序列以及含AAV2 ITR及EGFP表达框的序列分别构建到三个杆状病毒中，通过共感染Sf9细胞来生产rAAV，结果显示成功包装出rAAV病毒，且病毒活力较好。这种生产方式很容易放大，将为AAV载体产业化及临床应用奠定重要基础。

关键词：rAAV；杆状病毒；病毒生产

1. 引言

腺相关病毒（Adeno-associated Virus, AAV）是细小病毒(parvovirus)家族中依赖病毒属（Dependovirus）中的一员，最早于1965年作为腺病毒制备物中的一种污染成分被发现[1]，其复制性感染需要在腺病毒或单纯疱疹病毒的辅助下才能发生。AAV2基因组为单链线性DNA，大小为4.7kb左右，包含2个开放阅读框(ORFs)，左边Rep ORF的四个产物Rep78、Rep68、Rep52和Rep40主要负责病毒的位点特异性整合、复制和转录调控等；右边Cap ORF 的三个产物VP1, VP2和VP3主要负责病毒颗粒的装配，构成AAV的外壳并将AAV单链DNA基因组包裹在壳内形成成熟的AAV病毒颗[2][3]。AAV基因组的两端各有一个145bp 的末端重复序列(ITR)，其中靠近末端的125个碱基是一个较长的回文结构，自身能通过碱基互补配对进行折叠，使得ITR呈现出T字型的发卡结构，是AAV复制和包装所需的唯一顺式作用元件[4]。

rAAV只保留了两端的ITR序列，AAV的Rep及Cap基因由外源基因表达框替代。在生产rAAV时，只要提供Rep和Cap蛋白的反式功能以及其它辅助病毒的辅助功能，带有外源基因的重组AAV基因组就会被营救、复制并包装成rAAV病毒[5]。然而，临床上对AAV 载体的产量要求是比较高的，难以获得一种简单、易放大、安全性较好的高产量生产方式是阻碍其应用于基因治疗的一个重大瓶颈。由于杆状病毒不像腺病毒和单纯疱疹病毒那样会对人体产生毒性，最近基于杆状病毒-昆虫细胞的rAAV生产系统引起了广泛关注。杆状病毒-昆虫细胞生产系统需要以下两类反式组分：两个复制蛋白Rep78、Rep52以及三个外壳蛋白VP1、VP2、VP3。Urabe等[6]首次采用三个杆状病毒感染昆虫细胞来探索rAAV的生产，单个细胞的产量达到5×104个rAAV，且性质与传统的哺乳动物细胞产生的rAAV没有区别。我们在Urabe等人研究结果的基础上，合理改进杆状病毒载体，将Rep78与Rep52分开，分别与其它的Cap基因组合，这样避免了由于Rep78与Rep52的同源性造成重组杆状病毒的不稳定。在构建三个杆状病毒Bac-AAV2Rep78Cap2+3, Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2EGFP后，通过共感染Sf9昆虫细胞来生产带EGFP的重组AAV。

1本课题得到国家自然科学基金(No.30772477)的资助。

2. 材料与方法

2.1 材料与试剂

质粒pSH3、p5E18-VD286和pAAV2-neo-EGFP由本实验保存；pFastBacDual载体、DH10Bac™大肠杆菌感受态、Purelink™ Hipure质粒纯化试剂盒、Sf9昆虫细胞、Cellfectin®转染试剂、Sf-900II SFM无血清培养基购自Invitrogen公司；293T细胞购自ATCC；KOD-Plus 聚合酶及SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自TOYOBO公司；各种内切酶及DNA Marker 购自NEB公司；RNA酶、Solution I连接酶购自Takara公司；Nucleospin胶回收试剂盒购自Macherey-Nagel公司；蛋白酶K、QiaAmp DNA Blood Mini Kit购自QIAGEN公司；FBS、DMEM培养基及胰酶购自GIBCO公司。

2.2 方法

2.2.1 载体构建

首先合成以下引物（划线部分为内切酶识别位点）：

1 CCGCTCGAGATGGAGCTGGTCGGGTG

2 CCGCTCGAGATGCCGGGGTTTTACG

3 CTAGCTAGCTTATTGTTCAAAGATGC

4 GGACTAGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTC

5 GGACTAGTACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGC

6 GCTCTAGAGCAATTACAGATTACGAGTC

以含AAV2基因组的质粒pSH3为模板，用引物1和3扩增Rep52基因序列，引物2和3扩增Rep78基因序列，Xho　&Nhe　双酶切后分别经Solution　连入经相同酶切的pFastBacDual载体，得到pFBD-AAV2Rep52和pFBD-AAV2Rep78；然后以pSH3为模板，用引物4和6扩增Cap1基因序列，引物5和6扩增Cap2+3基因序列，Spe　&Xba　双酶切后分别经Solution　连入经相同酶切的载体pFBD-AAV2Rep52 和pFBD-AAV2Rep78，连接产物经多种酶切鉴定并送测序正确后，得到两个重组载体pFBD-AAV2Rep52Cap1和pFBD-AAV2Rep78Cap2+3（图1 (a) (b)）。

图1 构建的三个重组pFBD载体示意图

Figure 1 Schematic representation of three recombinant pFBD vectors 然后合成两条引物，经退火后形成两端为Xho　和EcoR　粘性末端的Linker，该Linker 内部引入了Apa　识别位点。首先将Linker连入经Xho　&EcoR　双酶切的pFastBacDual 载体，去掉内部P PH及P10两个启动子，得到pFastBacDual-Linker，然后用Apa　、Sma　分步酶切，回收后一端是Apa　的粘性末端，一端是平末端；Apa　、Hpa　分步酶切质粒pAAV2-neo-EGFP，回收2454bp的片段，该片段包含AAV2的两个ITR及EGFP的表达框，一端是Apa　的粘性末端，一端是平末端，将该片段连入上面经酶切的pFastBacDual-Linker，