第2章 基因工程制药(二)

⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清igG含量测定 ⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品干扰素效价测定、无菌试 验、热原试验。
3.2 成品检定 ⑴物理性状 ⑵鉴别试验 ⑶水分测定 ⑷无菌试验 ⑸热原试验 ⑹干扰素效价测定 ⑺安全试验
二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子


表达的Ala125 IL-2可占菌体总蛋白的42.7%。 超声波裂菌 离心收集包含体 SephacrylS200凝胶过滤 氧化剂复性 透析除盐 获得纯品 产品纯HPLC分析鉴定，纯度可达99%以上， 用3H-TdR掺入法进行活性测定，比活性 1×107U/mg，比野生型IL-2比活性平均提 高30%。


bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽， 其氨基酸序的55％和aFGF相同，分子量为16～18.5 KD。bFGF分子结构中有4个半胱氨基酸，以此形 成分子的三维空间结构。由丝氨酸取代半胱氨酸的 重组bFGF的生物学活性不变，而单链多肽则易于 在大肠杆菌中表达 。

bFGF基因位于人的第5对染色体上，为单拷贝基因， 呈不连续状态，其功能区被两个内含子隔开分为三 个外显子区域。 bFGF有很强的肝素亲和力。bFGF基因中未发现信 号肽顺序，可经自分泌方式释放 。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GMCSF） 是一个具有多项潜能的造血生长因子，它不仅能够 促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟，而且对其 它的细胞，如抗原递呈细胞、成纤维细胞、角质细 胞、皮肤粘膜细胞等，均有着不同程度的刺激作用。 GMCSF对某些疾病，如肿瘤患者放疗、化疗以后 的白细胞减少症、再生障碍性贫血和骨髓移植的治 疗有重要作用，以及在抗病素、抗真菌感染等的治 疗中也有良好的疗效。
①



发酵 甘油保存菌划平皿，挑取单菌落，接种于LB种 子培养基中，18h，再扩大培养12h，接种于30L 发酵罐，30℃培养，过程中流加50%的葡萄糖、 酵母浸出液及酷素水解物。 培养20h左右时开始表达，28h表达是高峰，之 后细菌开始死亡，杂蛋白增加。 培养过程中，尤其是对数期，用葡萄糖的加量 来控制细菌生长速度，以免溶氧量下降过快。 发酵产物为分泌型GMCSF，占菌体总蛋白的 25%以上。


1. 重组人白细胞介素-2

重组人白细胞介素-2是通过反转录PCR技术从外周 血单个核细胞中克隆到人的白细胞介素-2 cDNA， 再通过基因定点突变技术，针其第125位半胱氨酸 的密码子突变为丙氨酸或丝氨酸的密码子，从而 防止分子内二硫键的错配或分子间二聚体的形成， 增强药物的稳定性与生物活性，减少不良反应。
在临床应用上与普通IL-2比较，改构体的活性增高， 疗效增强，半衰期延长，热稳定性好，纯度高， 不良反应显著减少。

1. 重组人白细胞介素-2工程菌的生产
重组时利用定点突变方法将天然IL-2的第 125位氨基酸由Cys改为Ala（密码子由TGT 变为GCT），获得新型IL-2—— 设计并人工合成两条寡核苷酸引物： 引物1：5’-AGC AAT TCC ATG GCA CCT ACT TCA AGT-3’ 引物2：5’-AT GGA TCC TTA TCA AGT CAG AGT CGA GAT GAT GCT TTG AGC AAA GGT-3’


现在可以利用基因工程技术在大肠杆菌中表达、 发酵来生产干扰素。
1.基因工程菌的组建

组建过程：分离干扰素mRNA，以mRNA为模板 反转录合成cDNA，将cDNA克隆到载体中并转化 大肠杆菌K12，获得干扰素基因工程菌。 所克隆的干扰素cDNA是从抗病毒活性最高的 12SmRNA区域合成的。 克隆载体pBR322质粒，含有四环素和氨苄青霉素 抗性基因。
三、人白细胞介素-2

人白细胞介素-2（interleukin-2, IL-2）是由 T淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，为一种多肽 类药物，又称T细胞生长因子。其在机体免 疫应答中具有重要作用，是一种免疫增强 剂，具有抗病毒、抗肿瘤及改善和提高机 体免疫功能的作用。

天然白介素-2由396个核苷酸加上起始密码和终止 密码组成，编码133个氨基酸，其中含有三个半胱 氨酸（58、105和125位），第125位Cys的巯基游离， 易引起IL-2分子内二硫键错配或分子间二聚体的 形成，从而降低IL-2的生物活性与稳定性，同时 增加其不良反应。 重组的未加改构的人白介素-2多以包含体形式表 达，在变性与复性过程中易形成二硫键错配，为 进一步提纯带来困难。 为解决上述问题，可将重组IL-2经过密码子突变， 将第125位的半胱氨酸改为丙氨酸。
rhIL-2产品
四、重组碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)

早在1940年，Hoftman等在脑和垂体的抽提物中发现一种 能够促进成纤维细胞生长的物质。1974年该物被分离纯化， 并命名为成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor， FGF）。接着，人们又分离出一种与之高度同源的物质， 由于它含有较多的酸性氨基酸碱基，等电点为酸性 （5.6），故命名为酸性FGF（aFGF）。先发现的FGF因 对酸和热敏感，等电点呈碱性（9.6），则称为碱性FGF （bFGF）。 现今资料表明，bFGF的生物学作用极其广泛，它在血管 形成、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生和神经组 织生长发育过程中起着十分重要的作用。


将粗酶液置入纯酶仪中分离，去杂质，再加入4℃的等量 体积的去离子水，超滤浓缩，得等量体积50％的SOD的粗 抽提液，再向粗抽提液中加入等量4 ℃的冷丙酮，分级沉 淀，去除底部杂质，得SOD浓缩液 将SOD浓缩液用2倍体积的去离子水溶解，再次置入每分 钟2000转的离心机中，离心分离，除去沉淀杂质，得SOD 浓缩清液，将浓缩清液4℃冷冻48小时静止后，除去沉淀 杂质，超滤浓缩，冷冻干燥，即得药用SOD冻干品，该产 品酶活性为8000U～15000U/mg。

PCR扩增得到0.4kb大小的DNA片段， 经鉴定为含Ala125突变的IL-2基因。PCR片 段用EcoRⅠ-BamHⅠ双酶切。 将表达质粒pBV220同样用EcoRⅠBamHⅠ酶切，并用T4DNA连接酶使之与 PCR扩增的重组IL-2编码基因连接，得到重 组质料pBV220/IL-2。 将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，得 到Ala125IL-2的工程菌株。
制备种子液ห้องสมุดไป่ตู้发酵培养 粗提
启开种子
半成品检定
半成品制备
精提
分装
冻干
成品检定
成品包装
α2b干扰素生产过程
1.发酵

工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒 用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。


培养基含1%蛋白冻、0.5%酵母提取物、0.5% NaCl。
接种后摇床培养30℃，10h，发酵种子。 15L发酵罐培养，30℃，转速500r/min，8h。 然后42℃下诱导，2～3h。离心去上清。
2.产品的提取与纯化 4000r/min离心30min，去上清后，湿 菌超声破碎，离心，取沉淀部分用溶 解缓冲液进行处理，上清超滤浓缩， Sephadex G-50 分离。 经SDS-PAGE检查。 再经DE-52柱纯化。

3. 质量控制标准和要求
3.1 半成品检定 ⑴干扰素效价测定 ⑵蛋白质含量测定 ⑶比活性 ⑷纯度测定 ⑸相对分子量测定
第二章 第十三节
基因工程药物 的制造实例
一、干扰素

干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌 的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗 肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重 要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异 分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素再分 为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别表现为个别 氨基酸的差异。 早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的， 产量低、价格昂贵，不能满足需要。
2. 质量控制标准和要求
①
②
半成品检定 主要包括下列项目：蛋白质含量测定，活性测 定，比活性测定，相对分子质量测定，纯度测 定，核酸含量测定，鼠IgG含量测定，等电点测 定，无菌试验，热原质等。 成品检定 主要包括下列项目：外观检查，活性测定，水 分测定，无菌试验，安全毒性试验，热原质试 验，肽图测定等。

基的密码子。
重组人粒 细胞巨噬 细胞集落 刺激因子 产品
1. 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因 子的制备

利用表达分泌型GMCSF工程菌W3100/ pGMCSF可以表达具有天然结构和生物活 性的GMCSF，表达量高，易于纯化，无需
复性，纯化的GMCSF比活高于包含体型，
但其发酵表达技术较难掌握。
分泌型GMCSF工菌型 W3100/pGMCSF发酵工艺


国内第二代基因重组h-bFGF也已经问世，并正 式批准生产。 rh-bFGF工程菌的载体多用PUC系列质粒，含有 氨苄抗性、LAC启动子，以大菌杆菌作为宿主。


生产时使用IPTG诱导表达，rh-bFGF可分泌至 胞浆中，采用连续流加葡萄糖的高密度分批发 酵工艺，经11h后可获得产量达200mg/L的bFGF， 经亲和层析（多用肝素亲和）纯化后可获得高 纯度的bFGF，其理化及生物学特点符合药用要 求。


pBR322 质 粒 结 构 图
重 组 人 干 扰 素 产 品

组建干扰素工程菌的流程
诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱获得mRNA 5%～23%蔗糖密度梯度离心提取12S的mRNA 自mRNA反转 录成cDNA 双链cDNA用末端DNA转移酶接上dT或dG尾
pBR322质粒
pBR322质粒DNA的PstⅠ酶切割加上dA或dC
退火获得杂交质粒
转化大肠杆菌K12
扩增杂交质粒
筛选抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌克隆 用已知干扰素的DNA片段作为探针挑选富有干扰素cDNA的克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达
2. 基因工程干扰素的制备

制备基因工程α-干扰素工艺流程如下：
②
发酵产物收集、纯化




离心 离子交换层析或亲和层析纯化 超滤浓缩，分子筛 除菌过滤、分装、冻干

近年应用较多的还有融合蛋白表达GMCSF的方法。 采用ＰＣＲ方法改建人粒细胞－巨噬细胞集 落刺激因子的ｃＤＮＡ，３′换用ＴＡＡ终止密 码，将其克隆入多种不同表达融合蛋白的载体中， 并在ｃＤＮＡ与上游细菌蛋白基因之间嵌入凝血 酶接头，导入适当宿主后均获得高效表达，表达 融合蛋白经凝血酶消化后释放出Ｎ－末端与天然 成熟蛋白一级结构（糖基化除外）完全相同的ｒ ｈＧＭＣＳＦ，经层析纯化可得到适宜人体应用 的活性蛋白。


1985年Sieff等发表了第一篇有关重组人粒细胞巨 噬细胞集落刺激因子的文章后，这些年来有关 rhGMCSF研究报道的文献每年均在千篇左右。 GMCSF是糖蛋白，相对分子质量为22000，基因 定位在第5条染色体长臂上，基因约2.5kb，含有4 个外显子和3个内含子。其mRNA包括编码成熟蛋 白质的127个氨基酸残基和信号肽的17个氨基酸残

将含有人体SOD基因的PCR252载体的大肠杆菌接种子培 养基中，在32 ℃的温度下，发酵培养24小时，再加入占发 酵液重量1％的硫酸铜清液，再向发酵液加入3倍体积的去 离子水，用震动式破碎机剧烈震动破碎30min，静置 20min，置入每分钟2000转的离心机中，离心分离，除去 沉淀杂质，得清澈透明粗酶液。
五、重组人超氧化物歧化酶（rh-SOD）



SOD是一种生物高效抗氧剂，能特异性消除氧自 由基。而rh-SOD不仅仅在类风湿关节炎、心血管 等疾病上有独到之处，还广泛应用于保健品、化 妆品领域， 天然SOD制品是从牦牛血液中提取的，主要以红 细胞为起始材料，投资大、能耗高、收率低、成 本高，价钱十分昂贵。 基因工程的方法：从胎肝中获取微量rh-SOD后， RT-PCR得到SOD cDNA，在大肠杆菌中克隆表达， 并通过rh-SOD工程菌的发酵、纯化的研制，在模 拟生产条件下进行中试工艺放大，纯化后得到rhSOD产品。