植物细胞培养的基本技术

细胞分裂素： 主要促进细胞分裂和愈伤组织上或器官上分 化不定芽。 常用的有： 6-苄（biàn）基嘌呤（BAP） 6-苄基腺嘌呤（6-BA） 激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT） 玉米素（zeatin、zt） 异戊稀氨基嘌呤（2-ip）
高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 刺激细胞分裂 低浓度生长素和高浓度生长素分裂素 刺激细胞生长
第四节 植物细胞培养的基本技术
一、植物材料的准备
二、培养基的准备
三、培养方法的选择
1、外植体
外植体：
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或 组织的片段。
在继代培养时，将培养的组织切段移入新的 培养基时，这种切段也称外植体。
来源：
（1）、生长健壮 在生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正 常的器官或组织。 原因： a、代谢旺盛 b、再生能力强（比较容易培养成功）
悬浮培养可分为静止和振荡两类。

成批培养法

半连续培养法
连续培养法


固定化培养法

将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中， 最后一次收获的培养方式。
成批培养特点： 培养基体积固定培养过程中，细胞生长，其 数目不断发 生变化，呈S增长。
成批培养意义： 它是进行细胞生长和细胞分裂的生理 生化研 究常用的培养方法。 但要进行下一批培养，则生长一定时间后， 需要继代转移。
（2）、不同部位 ： 靠近植株的近基部比较易成功。
选取：
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物 材料而异。 材料太大:易污染，也不需要； 材料太小:多形成愈伤组织，甚至难于成活。 一般选取培养材料的大小，在0.5cm—— 1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料， 则应更小。
植物组织培养的外植体必须是无杂菌材 料。培养前要进行严格的灭菌处理。

在反应器中投料和接种培养一段时间后， 将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培 养方法

将愈伤组织培养在一个恒定溶剂的流动系 统中，以使培养系统中的细胞数量和营养 状态保持稳定。
流动系统：一方面以一定速率不断地加入 新的培养基，另一方面又以相同的速率流 出培养物

连续培养意义： 植物细胞代谢调节的研究(某种生长限 速浓 度-细胞生长的影响); 次生物质的大量生产。
大量元素： 使用浓度大于30mg/L的无机元素 包括N、P、S、K、Mg、Ca、Cl和Na
微量元素： 使用浓度低于30mg/L的无机元素、 如Fe、B、Mn、I、Mo（钼），以及极微量 的Cu和Zn。某些情况下，还可加入Ni、Co或Al
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常使用的碳源：
糖类、肌醇 有时也用甘油等物质代替
植物生长调节剂：

但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上 述现象。
有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 或各种氨基酸。 对细胞早期生长有利
氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源的 供应 苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸，通过灭活位于叶 绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利 用 精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。
培养基必须加入B族维生素（B1、B6和泛酸）

采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和 中孔纤维膜等多种类型
固定化培养法突出优点：
细胞位置固定，
易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物 理化学梯度； 利于细胞组织化，
易于控制培养条件及获得较高含量的次级 代谢产物。
谢谢观赏
是用于调节植物生长发育的一类药剂，包括 人工合成的具有天然植物激素相似作用的化 合物和从生物中提取的天然植物激素。
到目前为止，已发现植物组织中可以形成5种 植物激素：
生长素（最早被发现的植物激素） 分裂素 赤霉素 脱落酸 乙烯
生长素： 用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化。 组织培养中常用的生长素有： 吲哚乙酸（IAA）：第一个被发现的内源激素， 是最先被人工合成的生长调节剂 二氯苯氧乙酸（2,4-D） 萘乙酸（NAA） 吲哚-3-丁酸（IBA） 萘氧乙酸（NOA） 对氯甲苯乙酸（P-CPA） NAA、IAA、IBA易引起生根 2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长
常用的固化剂： 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶
定义： 把细胞或生物体的一部分，置于液体培养基中使其 发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培 养的一种方法。
液体培养系统包括：
小规模的悬浮培养； 大规模的成批培养； 半连续培养； 连续培养。
悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或 摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞 团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的 一种培养方式。
（1）、需要 （2）、需要 （3）、需要 （4）、需要 （5）、需要
大量无机盐 碳源 植物生长调节剂 有机氮源 维生素
根据无机离子在细胞内的作用分为四大类： 1、大分子的结构成分：主要是C、H、O、 N、P、S等； 2、各种酶反应所需的主要离子，包括 Ca2+、Cu2+、Mg2+、K+、Na+、Cl－等； 3、各种酶活性所需的基础微量元素，包括： Co2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+等； 4、某些生物特殊需要的微量元素，如碘、 铯、溴等。
植物材料灭菌后，即可进行培养
培养基是“无菌土壤”，营养成 分可以根据代谢特点进行调控。
MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、 White等。 MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和 Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养设 计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳 定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分 的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生 理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培 养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。 B5含有较低的盐离子，这个成分可能对很多 培养物的生长有抑制作用。 White的无机盐含量较低，适于生根培养。
还需加入一定量的生物素和肌醇（是构成磷 酸肌醇【细胞膜脂质部分含磷酸肌醇2%~8%】 极性端的组分）
1、培养方法
植物细胞/组织培养方法分类：
原生质体培养 按 培养对象 分 单倍体细胞培养
固体培养 按 培养基类型 分 液体培养
定义： 利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养 特点： 简便易行、培养所占空间小
种质库（种质库是用来保存种质资源（一般 为种子）的低温保存设施。 国家种质库是全国作物种质资源长期保存与 研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国 际植物遗传资源委员会的部分资助下，于 1986年10月在中国农业科学院落成，隶属于 作物品种资源研究所。）
2、外植体的消毒
污染：是指在组织培养过程中培养基和培 养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 （1）、从病源菌方面来分析主要有： 细菌 真菌 （2）、从污染的途径而言主要是： 外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底、 操作人员未遵守操作规程等。
选择灭菌剂的原则： （1）、 灭菌后易除去或易分解； （2）、 敏感的外植体的灭菌时间不宜过长 不敏感的外植体的灭菌时间应适当延长
氯化汞灭菌效果最好，但去除也最困难， 且灭菌时间不宜过长，以免损伤或杀死植物 细胞。
氯化汞作为休眠种子的灭菌剂最为理想， 适用浓度为0.1%，灭菌时间一般为 2~10min，用于有较厚种皮的休眠种子灭菌 时，可延长到20min或更长时间。