天然药物青蒿素的合成及研究进展

天然药物青蒿素的合成及研究进展
摘要：青蒿素是目前治疗疟疾的特效药。

本文对自青蒿素发现以来的最新研究进展进行了比较详尽的综述。

内容包括:青蒿素的发现及历史，青蒿素的来源，青蒿素的全合成，青蒿素的生物合成以及植物组织培养生产青蒿素，并对青蒿素生物合成的发展前景进行了展望。

关键词：青蒿素全合成生物合成展望
0. 引言
青蒿素（artemisine ）是从中药青篙（菊科植物黄花蒿的地上部分干燥物）中提取的有过氧基团的倍半萜内酯抗疟新药，是我国发现的第一个被国际公认的天然药物，在其基础上合成了多种衍生物，如双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。

青蒿素类药物毒性低、抗虐性强，被WTO 批准为世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物
[1] 。

而疟疾是严重危害人类健康的疾病之一，据世界卫生组织（WHO ）统计，目前世界上仍有90 多个国家为疟疾流行区，全球每年发病人数达3亿〜5亿，年死亡人数达100万〜200万，其中80 %以上的病例发生在非洲，因此对青蒿素的需求量逐年增加。

但目前世界青蒿素药物生产主要依靠我国从天然青蒿中提取,产量受资源、环境和季节的限制，且生产成本高、产量低、难以满足市场需求。

青蒿素虽已能人工合成,但成本高、难度大,也未能投入生产。

因此，为增加青蒿素的资源，世界各国都在加紧开展青蒿素及其衍生物的开发研究,长期稳定地和大量地供应青
蒿素成为各国科学家面临的严峻考验
近几年，人们试图通过化学合成和生物合成技术来解决青蒿素的生产问题。

本文将对目前国际上青蒿素研究的现状从以下几个方面进行论述。

1.青蒿素的发现及历史
青蒿作为药物可以从2000年前，长沙马王堆出土的医书《五十二病》记载中发现，当时是用作治疗痔疮的。

500年后，晋代葛洪《肘后备急方》记载，青蒿就用来进行抗疟治疗了，只不过以前都是把疟疾当成热病。

医药经典著作《本草纲目》也作了同样的记述。

我国对青蒿素的研究始于60年代中期，在周总理亲自批示下，先后组织60多个科研单位和500多员研究人员坚持不懈的深入研究，研究项目包括：新抗疟药物研治、驱蚊药物及措施等，其中包括从中草药中寻找新型药物及对其进行药效筛选。

1973年，中国中医研究院中药研究所、山东省中医药研究所、云南省药物研究所分用乙醚、丙酮和石油醚从青蒿中提取到了抗疟有效成份青蒿素I。

并于1976年通过化学反应、光谱数据和x射线单晶衍射方法证明其为一种含有过氧基的新型倍半萜内酯，分子式为c H : Os，其分子结构如下图所示［2］，其绝对构型由刘静明等通过旋光色散和氧原子的反常散射测定
［3］。

'
2.青蒿素的来源
目前青蒿素的获得主要靠从青蒿中直接提取。

青蒿虽在世界各地均有分布，
但青蒿素的含量随产地的不同差别很大。

除我国少数地区外，绝大多数地区生长的青蒿中青蒿素的含量都很低（wi%o）［4］。

在我国，青蒿中青蒿素的含量从南到北基本呈递减趋势。

桂、黔、川青蒿资源丰富，青蒿素含量也较高，四川酉阳地区黄花蒿的青蒿素含量平均为0.885 3% [5]。

越南、印度等国家也有少量青蒿资源。

青蒿中青蒿素含量偏
低，提取成本高，导致青蒿素价格居高不下，难以满足市场需要。

3.青蒿素的全合成
青蒿素是具有过氧基团的新型倍半萜内酯，其分子式为C15H22 O5 ，相对
分子质量为282.33[5] 。

化学合成青蒿素这一复杂的天然分子是有机化学家所面临的挑战。

Schmid[6] 等1983 年报道了一条应用关键化合物烯醇醚在低温下的光氧化反应引进过氧基的全合成路线，反应以(-)-2- 异薄荷醇为原料，保留原料中的六元环，环上三条侧链烷基化，形成中间体，最后环合成含过氧桥的倍半萜内酯。

1986 年, 徐杏祥[7]等人报道了青蒿素的全合成途径[8-10],其合成以R(+)- 香草醛为原料,经十几步合成青蒿素, 合成途径如图2 所示。

还有多种以不同原料为出发点进行青蒿素一类物的化学合成研究。

1994年,Zhou和Xu[11]综述了国
内外青蒿素全合成的研究进展。

青蒿素全合成研究虽已取得一些明显的进展,但由于反应过程繁琐，反应过程中构型反转，副产物众多，原料昂贵等问题，使得全合成方法有成本高，难合成，产率低等缺点，到目前尚未显示出商业的可行性。

图2青蒿素览学合成途轻
3.青蒿素的组织的培养
利用植物组织培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的另一热点，它为大规模生产青蒿素的提供了可能。

目前在青篙芽、青篙毛状根和青篙发根农杆菌等培养体系中进行的青篙素合成技术极有可能被应用于工业生产。

a.青蒿芽
Ferreira等］12］在青蒿芽的培养过程中，检测到青蒿素的存在，并在诱
导生根的青蒿芽中获得了高含量的青蒿素，约为干重的0.02% ;改进培养基中的各种金属离子和复合维生素对芽中青蒿素的合成影响不明显，但添加赤霉素使得芽中青蒿素的含量提高了3〜4倍。

Woerdenbag等］13］在诱导的青蒿芽培养物中也检测到了青蒿素，并发现赤酶素和水解蛋白对芽中青蒿素的合成具有强刺激作用，为培植青蒿芽并提取青蒿素提供了依据。

国内有耿飒、叶和春、张龙等［14-16 ］用不同发育阶段的的花蕾和花器官
为外植体诱导丛生芽，并通过诱导丛生芽研究青蒿素生物合成相关因素，结果发现转基因青蒿中青蒿素含量相应提高。

b.青蒿毛状根
郭晨等［17,18 ］在硫化床生物反应器中培养青蒿毛状根取得了较好的效果，进一步探索不同培养方式以及生物反应器形式将为今后反应器的的商业化应用奠定基础。

研究了不同温度（15〜35 °C）对青蒿毛状根生长和青蒿素生物合成的影响，发现25 C有利于毛状根生长，30 C促进了青蒿素生物合成。

通过温度改变的二步培养技术（培养前20 d温度控制在25 C,后10 d温度提高到30 C）, 青蒿素的产量得到明显提高，高于在恒温培养时（25 C或30 C）的结果。

刘春朝等［19］对影响青蒿毛状根生长及青蒿素合成的培养条件的如温度和光照等也进行了研究，发现在适宜光照、温度等条件下获得青蒿素的产量比原来有所提高。

c.青蒿发根农杆菌培养
研究发现发根与正常的未转化根是有差异的；发现离体培养的青蒿不定芽上发根对青蒿素生物合成有促进作用；天然生长的青蒿株根中不含青蒿素。

因此，在大量培养发根生产青蒿素时，发根生长停止后就可以立即收获并提取青蒿素。

蔡国琴等［20］用发根农杆菌转化药用植物青蒿并建立了发根体外培养系统，通过Southern杂交、NPT U酶的检测证实了T-DNA转移并整合到植物的基因组上。

刘本叶、叶和春等［21］从747 条发根农杆菌ATCC15834 转化的青蒿株系025 发根中，筛选出7个生长较快的发根系，这7 个系在生长速度和青蒿素含量上均有显著差异，其中发根系HR-9青蒿素收率最高，达到每月33.25 mg /L。

青蒿发根的生长量和青蒿素含量极显著高于未转化跟和愈伤组织。

青蒿发根在分批培养中没有明显的迟滞期，接种后第7 d 进入指数生长期，第11 d 生长最快，第
20 d 进入稳定期。

青蒿发根中青蒿素含量呈明显的“与生长相关”特性，在指数生长期，青蒿素含量缓慢下降，生长速度减缓后，青蒿素含量上升，发根生长停止后，继续延长培养时间，青蒿素含量也不再提高。

在分批培养中，青蒿发根适宜的培养时间为21
d 。

d.青蒿素的生物反应器培养
青蒿植物组织培养技术的应用，必须有较好的培养体系，有相应的培养设备才能实现工业生产。

气升式反应器虽可改善培养基中氧传递，但长期浸泡易产生玻璃化现象，迄今尚无合理对策，只有解决了这个问题，才能实现工业化生产。

Fulzele等］22 ］利用1 L生物反应器进行青蒿芽的悬浮培养，经过30 d的分批培养可获得再生的植株，生物量提高了4〜5倍。

Park等利用2 L的长方形气提式生物反应器培养青蒿芽，经过4 周的培养，培养物增殖8 倍，获得的青蒿芽可长出不定根。

刘春朝等［23,24］研究了适用于青蒿发根及芽培养的生物反应器及控技术，利用超声雾化生物反应器、自制流化床生物反应器、自制气升式内环流生物反应器进行青蒿毛状根多层培养生产青蒿素，在一定条件和工艺下，产量有所提高。

雾化反应器中液体培养基生成雾滴还存在问题，且青蒿器官生长的表面液膜更新也较慢，所以目前离真正的工业化大生产还有一段距离，但科学工作者应该朝着这一方向去努力，以期能在提高青蒿素生物合成产量上有所作为。

4.青蒿素的生物合成路线
a.青蒿素前体生物合成青蒿素生物合成途径中的中间体的研究，是青蒿素生物合成
代谢的重要途
径。

目前，已探测到与青蒿素生物合成有关的中间体有十几种左右，其中最为重要的为青蒿酸、青蒿素B、脱氢青蒿素、杜松烯等。

实际上青蒿素合成途径是植物固醇合成的分支途径。

汪猷等［25］在青蒿的匀浆中放入放射标记的青蒿酸，结果在青蒿素和青蒿素B
中检测到放射性标记，认为在青蒿中由MVA 合成青蒿素和青蒿素B 的过程中，青蒿酸是一种重要的中间产物，并通过植物激素调节可以合成青蒿素的黄花蒿培养细胞中，缺乏青蒿素合成前体是青蒿素合成量低的重要原因。

因而大力开展青蒿素合成前体的研究是提高青蒿素合成产量的关键。

近年来，出现了以二氢青蒿素为原料的两种合成路线：二氢青蒿素与三氟乙酸酐反应制得三氟乙酰基二氢青蒿素，不经分离直接与酚类反应；二氢青蒿素与乙酸酐反应制得乙酰基二氢青蒿素后再与酚类反应。

2003 年，Abdin 等［26］证明了青蒿酸是青蒿素合成的中间体，发现11，13－二氢青蒿酸26 能转化为青蒿素。

Martin 等［27］用紫穗二烯合酶催化法呢基焦磷酸( FPP )环化制得了青蒿酸生物合成的前体紫穗二烯35.
b.青蒿素生物合成青蒿素合成前体和中间体的大量研究为青蒿素合成生物途径提供了丰富的素材。

近年来研究表明，青蒿素的生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径(图3)。

植物类异戊二烯的生物合成至少存在2 条途径，即甲羟戊酸途径(mevalonic acid，MVA)和丙酮酸/磷酸甘油醛途径(deoxyxylulose 5-phosphate ，DXP)。

青蒿素等倍半萜类的生物合成途径属于MVA 途径，该途径在细胞质中进行。

根据目前离体转化、活体转化及同位素饲喂试验结果，青蒿素的生物合成途径可能包括2 种方式，见图4、5。

其中，第1 种青蒿酸氧化途径可能为植物中青蒿素的主要生物合成途径。

生物合成青蒿素的途径近年来引起了广泛关注，但目前的工作仅涉及合成青蒿素的生物合成中间体［28］，而青蒿素最终产品的研究进展不
大，且鲜见报道。

但这恰恰是可能提高青蒿素市场供给的最重要途径，
因此要全
面加大青蒿素最终产品生物合成的研究力度。

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图3植物类异戊二烯代谢途径
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图5
5.青蒿素生物合成关键酶及其基因调控
a.3-羟基-3-甲基戊二酰GoA还原酶（HMGR）
HMGR催化HMG-CoA形成甲羟戊酸（MVA），由于MVA的形成是一个不可
逆过程，故HMGR被视为MVA途径中的第1个关键酶，具限速作用。

HMGR
是萜类化合物代谢中的重要调控点，尤其是倍半萜类物质的合成，与HMGR活
性呈正相关。

Baldi等］29］研究了悬浮培养青蒿增加青蒿素产量的方法，通过增加所选的前体（甲基戊酸内酯）和诱导子（甲基茉莉花素）到最佳浓度，发展了整体增加青蒿素产量的策略，结果得到15.2血/L生物量及110.2 mg/L青蒿素，比对照组的产量高5.93倍。

近年来研究表明，HMGR基因是一个三基因（hmg1，hmg2，hmg3）组成的基因家族。

其基因家族成员的差异表达对MVA途径中萜类的生成起重要调控作
用。

应用3种马铃薯HMGR基因（hmg1，hmg2，hmg3）作为基因针，Choi等证明受伤诱导的固醇积累与HMGR1基因表达的诱导有关［30］。

Ya ng等］31 ］对一些模式植物（如马铃薯）的研究结果表明，HMGR U亚基因家族的成员表达与倍半萜类植保素的合成密切相关。

b.法呢基焦磷酸合酶（FPPS）
FPPS是一种1 ' 4-异戊二烯基转移酶，它催化IPP和DMAPP通过缩合作用形成GPP，GPP再与IPP缩合形成FPP [ 32-33 ]。

IPP 与DMAPP 是植物中萜类合成的共同前体，在相关酶GPP 合酶、FPP 合酶、GGPP合酶的作用下，IPP与DMAPP头尾缩合生成线性前体GPP、FPP、GGPP 。

其中，FPP 是倍半萜、三萜、多萜的共同前体。

在质体中，GPP 是单萜的前体，GGPP 是二萜、四萜、叶绿醌等的前体。

因此，要提高青蒿素的产量，提高FPP 的量是至关重要的。

提高FPP 的供应主要有2 种方式，一种是导入与FPP 合成相关的外源基因如HMGR 、FPPS[34-35] 。

另一种方式是减少FPP 流向萜类代谢的其他途径方法有反义RNA 技术及同源阻断等[36-37] 。

c.紫穗槐-4 , 11-二烯P450单加氧酶
植物细胞色素P450是分子量为40〜60 kDa、结构类似的一类血红素—硫铁蛋白，属于单加氧酶的超家族。

它以可溶性和膜结合2 种形态存在于植物细胞内，催化许多具有立体和区域特异性的氧化反应，目前已克隆90 多个植物细胞色素P450基因。

1999年Helliwell等]38]在生物合成植物激素赤霉素时证实了CYP的逐步催化。

2000年Wallaart [39[提出紫穗槐-4, 11-二烯中C12氧化是CYP 在脱氢酶和还原酶活性存在下催化的多级酶促反应。

2003 年Schuler 等发现，作为最大的植物基因家族之一，CYP 基因家族的基因序列差异巨大。

2005 年Bertea 等[40]首次从青蒿中检测到紫穗槐-4，11- 二烯
P450 单加氧酶的活性，利用气—质联用法首次在青蒿的叶及其腺毛体中检测到青蒿醇、二氢青蒿醇、青蒿醛、二氢青蒿醛和二氢青蒿酸。

6. 展望
综上所述，在现有的基础上，增强青蒿素的生物合成研究是增加青蒿素供给的重要方法。

加强青蒿素生物合成机理研究的同时，通过采用合适的青蒿素中间体、温和的反应条件和减少合成步骤，逐步实现工业化生产的应用研究。

增加青蒿素产量的关键是提高合成青蒿素成品的收率，同时还应加强生物反应器培养设备的研制，使青蒿素生物合成路线能适应工业化生产，这也是今后生物合成青蒿素研究工作的重中之重。

而通过其他各种辅助调控手段提高青蒿素生产的能力来增加青蒿素的供给，也必须在今后的研究工作中加以关注。

参考文献
[1].Klayman D L,Science,1985,228, 1049 — 1055.
[2].文U静明（Liu J M）,倪幕云（Ni M Y）,樊菊芬（Fan J F）,屠呦呦（Tu Y Y）,吴照华（Wu Z H）, 吴毓林（Wu Y L）, 周维善（Zhou W S）, 化学学报（Acta
Chim.Sinica）,1979,37, 129 —141.
[3 ]钟国跃，凌云 . 黄花蒿优质种质资源的研究[ J]. 中草药， 1998，29（4）:264 －267.
[4 ]钟凤林，陈和荣 . 青蒿最佳采收时期采收部位和干燥方式的实验研究[ J] . 中国中药杂志， 1997，22（7）:405 － 406.
[5 ]青蒿素结构研究协作组 . 一种新型的倍半萜内脂———青蒿素[ J ] . 科学通报， 1977（3）:142.
[6]Schmid G, Hofheinz W,J.Am.Chem.Soc.,1983,105, 624 —625.
[7] Xu X X, Zhu J, Huang D Z, Zhou W S,Tetrahedron,1986,42, 819 —828.
[8]Avery M A, Chong W K M, Jennings-White C,J.Am.Chem.Soc.,1992,114, 974 —979.
[9]Avery M A, Jennings-White C, Chong WK M,Tetrahdron Lett.,1987,28, 4629—4632.
[10]Ravindranathan T, Anil Kumar M, Menon R, Hiremath S V,Tetrahdron
Lett.,1990,31,755 —758.
[11]Z hou W S, Xu X X,Acc.Chem.Res.,1994,27, 211 —216.
[12]F eireica J F S ，Janick J.Floral morphology of artemisiaannua with special reference to trichomesl [J].Int J PlantSci ， 1995， 156（6）： 807-815.
[13]W oerdenbag H J ，Jos F J ，Win V U，et al.Production of the new anti-malarial drug artemsinin in shoot culture of Arteaiisia atinua LI [J ].Plant Cell Tissue Callus and OrgCuture ，1993，32： 247-257.
[14]耿飒，叶和春，李国凤，等 . 青蒿试管苗开花及用花器官为外植体诱导丛生芽生产青蒿素[ J]. 应用与环境生物学报， 2001，7（ 3）：201-206.
[15 ]张龙，叶和春，李国凤 . 青蒿无性系中青蒿素生物合成的相关因素[ J]. 应用与环境生
物学报， 2004， 10（3）：277-280.
[16 ]Geng S， MaM，Ye H C，et al.Effacts o f ipt gene expression on the physiological and biochemical characteristics of Ariemisia annua L [J].Plant Science ，2001，
161：691-698.
[17 ]郭晨，欧阳藩，叶和春，等 . 流化床生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素[ J]. 应用
与环境生物学报， 1998，4（ 4）：345-348.
[18 ]郭晨，刘春朝，叶和春，等 . 温度对青蒿毛状根生长和青蒿素生物合成的影响[ J] . 西北植物学报， 2004，24（10）：1 828-1 831.
[19 ]刘春朝，王玉春，欧阳藩，等. 青蒿毛状根合成青蒿素的培养条件研究[J]. 植物学报，
1998，40（9）：831-835.
[20 ]蔡国琴，李国珍，叶和春，等 .Ri 质粒转化的青蒿发根培养及青蒿素的生物合成 [J]. 生物工程学报， 1995， 11（ 4）： 315-320.
[21 ]刘本叶，叶和春 . 青蒿发根生长及青蒿素生物合成动态的研究[J]. 生物工程学报，1998，
14（ 4）：402-404.
[22 ] Fulzele D P ， Sipahimalani A T ， Heble M R.Tissue culturs of Artem isia annua ： organogenesis and artemisinin production [ J ].Phytotherapy Res，1991，5（ 5）：149-153.
[23]刘春朝，王玉春，郭晨，等 .流化床生物反应器培养青蒿毛状根生产[ J]. 应用与环境
生物学报， 1998， 4（ 4）：345-348.
[24]刘春朝、王玉春，康学真，等 . 利用新型雾化生物反应器培养不定芽
[25]汪猷，夏志强，周凤仪，等.青蒿素生物合成研究川化学学报，1988, 46: 1 152-1 153.
[26 ] Abdin M Z， lsrar M ， Rehman R U， et al.Atemisinin ， a novel antimalarial dtug ： Biochemical and molecular approaches for enhanced prodctction [J] .Planta Medica , 2003, 69（4）: 289-299.
[27 ] Martin V J J, Pitera D J, Withers S T, et al.Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids [ J] .Natur Biotechnology , 2003, 21（ 7）: 769-802.
[28] 白东鲁,陈凯先 . 药物化学进展[ M] . 北京:化学工业出版社, 2005.435-442 .
[29 ] BALDI A, DIXIT V K.Yield enhancement strategies for artemisinin pro-duction
by suspension cultures of Artemisia annua [ J] .Bioresource Tech-nology , 2008, 99（11）:4609 －4614.
[30 ]CHOI D, WARD B L, BOSTOCK R W.Differential induction and suppression of potato 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase genes in response to Phytophthora infestans and to its elicitor arachidonicacid [J].The Plant Cell Online , 1992, 4（10）:1333 －1344.
[31 ]YANG Z, PARK H, LACY G H, et al.Differential activation of Potato
3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase genes by wounding and pathogen challenge [J].The Plant Cell Online , 1991, 3（4）:397 －405.
[32 ]MATSUSHITA Y, KANG W, CHARLWOOD B V.Cloning and analysis of a cDNA encoding
farnesyl diphosphate synthase from Artemisia annua [ J] .Gene , 1996, 172（2）:207 －209.
[33 ]ZHAD Y J, YE H C, LI G F , et al.Cloning and enzymology analysis of far-nesyl pyrophosphate synthase gene from a superior strain of Artemisia an-nua L.[ J].Chinese Science Bulletin , 2003, 48（1）:63 －67.
[34 ] CHEND, YE H, LI G.Expression of a chimeric farnesyl diphosphate syn-thase gene in Artemisia annua L.transgenic plants via Agrobacterium tu-mefaciens-mediated transformation [ J] .Plant Science（Shannon , Ireland） , 2000, 155（2）:179.
[35 ]HAN J L, LIU B Y , YE H C, et al.Effects of overexpression of the endoge-nous farnesyl diphosphate synthase on the artemisinin content in Artemisia annua L.
[ J ] .Journal of Integrative Plant Biology ， 2006， 48(4):482 － 487.
[36 ]张毅，刘彦，王红，等 . 转青蒿反义鲨烯合酶基因对烟草鲨烯合酶基因表达的影响[ J] . 农业生物技术学报， 2005， 13(4):416 － 422.
[37 ]YANG R Y，FENG L L， YANG X Q，et al.Quantitative transcript profiling reveals down-regulation of a sterol pathway relevant gene and overexpression of artemisinin biogenetic genes in transgenic artemisia annua plants [J ] .Planta Med ，2008，
74(12):1510 － 1516.
[38 ]HELLI W ELL C A，POOLE A，PEACOCK W，Jet al.Arabidopsis ent-kaurene oxidase catalyzes three steps of gibberellin biosynthesis [ J] .Plant
Physiology ，1999，119(2):507 － 510.
[39 ]WALL A ART T E ， PRAS N，BEEKMAN A C，et al.Seasonal variation of artemisinin and its biosynthetic precursors in plants of Artemisia annua of different geographical origin:proof for the existence of chemotypes [J ] .Planta Medica ，2000， 66(1):57.
[40 ]BERTEA C M，FREIJE J R ，VANDER W H，et al.Identification of intermediates and enzymes involved in the early steps of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua
[ J] .Planta Medica ， 2005， 71(1):40 －47.。