常用分子生物学技术的原理及应用

Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354
名称相对于Southern blotting
相同点： 原理均为毛细作用。 不同点
•转移的是RNA •转移前无需酶切 •转移效率较高 •变性方法
（二）RNA印迹技术
Northern blotting 用途 • 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平。 • 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
用已知的特异 抗体检测目的 基因蛋白
重组人酪蛋白激酶2α SDS-PAGE purified recombinant human CK2α(重组人酪蛋白
激酶2α) subunit and its Western blotting
三
种
印
迹
技
水平槽
水平槽
垂直槽
术
的
比
较
Southern blotting Northern blotting Western blotting
寡核苷酸探针
探针的种类
基因组DNA探针 cDNA探针
RNA探针
探针技术的概念
将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进 行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序 列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放 射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有 同源的核酸分子存在。
二、印迹技术的类别及应用
其他印迹Fra Baidu bibliotek术
• 斑点印迹 (dot blotting) • 原位杂交 (in situ hybridization) • DNA芯片技术 (DNA chip)
斑点印迹 (dot blotting)
A Dot blot is a technique in molecular biology used to detect biomolecules. It represents a simplification of the northern blot, southern blot, or western blot methods.
Northern blotting 结果
由于基因组测序的完成 及基因芯片技术的成熟 以上两种技术应用的越
来越少
（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹)
与DNA和RNA印迹相似之处
首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小 分开，再将蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上， 蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。
与DNA和RNA印迹不同之处
辣根过氧化酶（HRP）使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含 有增强剂这使得发光增强了1000倍。经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标 记一抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发
射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。
Western blotting应用
原始文献出处
Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper（重氮苄氧甲基纸） and hybridization with DNA probes.
2. 印迹(blotting)定义
将存在于凝胶中的生物大分子转移（印 迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分 析的技术。
3. 应用 广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测
4. 发展 电转移印迹技术、
真空吸引转移印迹等
（二）探针技术
探针(probe)的概念
是带有特殊可检测标记（放射性核素、生物素
或荧光染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能 够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用来检测 核酸样品中是否存在某一特定的基因。
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular hybridization & blotting technology
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在DNA复性过程中，把不同DNA单链分 子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一 定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形 成杂化双链的这种现象。
蛋白质的转移只有靠电转移。
蛋白质的检测以抗体作探针。
用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶 （HRP）标记第二抗体，底物显色来检测 蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂 结合以提高敏感度。
或用同位素标记第二抗体，放射自显影法 检测蛋白区带的信号。
Western blotting应用
• 检测样品中的特异蛋白质的存在。 • 细胞中特异蛋白质的定量分析。 • 蛋白质分子的相互作用研究。
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
（一）Southern blotting
内切酶
1 2M
基因组DNA
重物 纸巾
转移缓冲液
500g
支持物
DNA酶切片段
玻璃板 Whatman滤纸 NC膜或尼龙膜 凝胶 Whatman滤纸
12
NC或尼龙膜
与探针同源杂交的 基因DNA片段
Southert blotting用途
• 基因组DNA的定性与定量分析。
如对在基因组中特异基因的定位及检测等。
•重组质粒和噬菌体的分析。
放 射 自 显 影 照 片
（二）RNA印迹技术(Northern blotting)
杂交的原理实质是核酸分子的变性与复性过程
复性
RNA
DNA
（一）印迹技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
原始文献出处：
Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.
J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.
（一）印迹技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
琼脂糖分离的DNA片段 → 变性为单链 → 将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾 → 利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到 NC膜上，使之成为固相化分子。
载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与 另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有 互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的 DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子 的区带。