实验一抗血清制备

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不完全弗氏佐剂（Freundadjuvant）
它是将抗原水溶液与油剂（石蜡油或植物油）等量
混合，再加乳化剂（羊毛脂或叶吐温80）制成油包
水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂。
完全弗氏佐剂：在不完全佐剂中加入分枝杆菌（如
死卡介苗）
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佐剂的作用机理
1.改变抗原的物理性状
2.使抗原易被吞噬细胞吞噬
Contents
动物免疫血清制备
玻片凝集实验+二免疫 琼脂免疫扩散试验+三免疫
ELISA测定
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2010级生物技术专业
动物免疫血清制备技术
吉林大学人兽共患病研究所
授课人 卢士英 LOGO
概念 免疫原的制备 免疫动物 免疫血清的纯化 免疫血清的鉴定
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抗原与抗体的相互作用是免疫学检测的基础， 抗体作为重要的特异性免疫分子，已广泛用于 科学研究、临床诊断、治疗及预防中。 在免疫学检测中，抗体的质量直接关系到实验 方法的特异性和灵敏度。 因此，高质量的抗体应具备高特异性、高亲和 性和高效价等特性。 常用抗体：多抗、单抗
2、免疫的方法： 免疫原的剂量
抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。 细胞性抗原： 羊：108；兔：107；小鼠：106。 佐剂：附近或对侧，或者先注射佐剂，再注射抗原。 以免破坏细胞，影响免疫效果。 可溶性抗原： 小鼠：50～100μg；大鼠：100～200μg；兔：100～1mg， 合成免疫原为2mg；半抗原：20～200μg /次 与佐剂混合
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免疫血清的鉴定
1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA）
2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散） 3、纯度的鉴定（SDS-PEAG） 4、亲和力的鉴定—affnity指抗体与抗原结合 的牢固程度，以亲和常数表示。 测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非 竞争）结合等。
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四、免疫血清的保存
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二、免疫原的制备
免疫原—天然抗原、人工或合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原； 具体制备： 细胞性抗原、可溶性抗原、半抗原
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二、免疫原的制备 1、细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）
一般用新鲜细胞以无菌生理盐水或磷酸缓冲液洗涤 后配成一定浓度。 若系细菌抗原，则取新鲜培养物，经集菌作如下处 理，H抗原因不耐热用0.3％～0.5％甲醛处理，O 抗原耐热可加热100℃2h去除H抗原后应用。
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多 克 隆 抗 体
抗血清：
抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清， 一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。高效 价的抗血清用于研究工作以及疾病的诊断和治疗。
一种抗原能否引起抗体生成反应，一方面取决于抗原分子 表面有无抗原决定簇（Antigenic determinant），另一 方面取决于机体的免疫状态，当具备以上两个条件后，抗 体生成将遵循抗体生成的一般规律——初次反应和再次反 应。
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3、半抗原性免疫原的制备
化学法：
重氮化法 含有芳香胺的半抗原也可通过与亚硝酸反应形成重 氮盐，再与蛋白质的酪氨酸残基上的酚羟基、组氨 酸残基上的咪唑环或色氨酸残基的吲哚环反应。该 偶联方法可以通过重氮化后颜色的变化(红棕色) 判 断是否偶联成功。但该方法重氮化连接键不稳定、 副反应严重，可能引起蛋白大量的沉淀，需特别注 意。
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二、免疫原的制备 2、可溶性抗原制备： 可溶性抗原可以是细胞膜、细胞浆、细胞核及核膜 等细胞组成部分，也可能是经细胞分泌至体液中 的一些可溶性因子。常见的蛋白质、多糖和脂类 等。 细胞组成部分常需经过机械或酶解法等破碎、收集 整理离心获得粗制抗原，并通过选择性沉淀（饱 和硫酸铵、PEG）或层析等方法进一步纯化。
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3、半抗原性免疫原的制备
半抗原与载体的连接： 物理法：即利用电荷和微孔吸附半抗原 化学法：利用某些功能基团把半抗原连接到载体分 子上
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3、半抗原性免疫原的制备
化学法：
半琥珀酸盐法 某些带有羟基的半抗原可与琥珀酸酐反应形成带羧基的化 合物，再与载体上的氨基偶联形成完全抗原 碳二亚胺法 碳二亚胺(EDC)使羧基与氨基间脱水形成酰胺键，半抗原 上的羧基先与EDC 反应生成一个中间物，然后再与载体上 的氨基偶联形成完全抗原
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二、免疫原的制备 2、可溶性抗原制备： 抗原鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。 蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） 分子的质量—电泳、质谱 蛋白的纯度—电泳、高效液相层析 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹
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3、半抗原性免疫原的制备
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3、半抗原性免疫原的制备 化学法： 曼尼希法 曼尼希反应（Mannich反应，简称曼氏反应），也称 作胺甲基化反应，是含有活泼氢的化合物与甲醛和 二级胺或氨缩合，生成β-氨基（羰基）化合物的有 机化学反应。
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佐
剂
是一种非特异性免疫增强剂，预先或同抗原一 齐注射到机体，能增强对该抗原的免疫应答或 改变免疫应答的类型，此种物质被称为佐剂 （adjuvant）。 一、种类 1.无机佐剂 氢氧化铝、明矾 2.有机佐剂 微生物极其代谢产物 3.合成佐剂 多聚肌苷酸、胞苷酸 4.弗氏佐剂 不完全佐剂、完全佐剂 5.新型佐剂 C3d、Cpg基序、脂质体
3.促进淋巴细胞增殖、分化，从而增强机体的免疫
应答。
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三、免疫动物
1、免疫动物的选择： ①抗原来源与动物种属的关系（越近越差） ②动物个体的选择（年龄、体重与健康，性别） ③抗原性质与动物种类 ④抗血清要求：R型 能和很小量抗原结合形成沉淀线 H型 较少用于沉淀反应。
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三、免疫动物
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三、免疫动物
2、免疫的方法： 免疫的途径与其间隔时间
•皮内＞皮下＞肌内 ＞腹腔＞ 静脉＞口服
高度特异性的抗血清，• 低剂量抗原短程免疫法； 高效价的抗血清，大剂量抗原长程免疫法。
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三、免疫动物
2、免疫的方法： 免疫动物采血
颈动脉放血法 心脏采血法 断尾采血 眼球采血 静脉多次采血法
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免疫原
1.概念 能与淋巴细胞抗原受体 TCR 或 BCR 特异性结合，刺 激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并与相应免疫 应答产物在体内外发生特异性结合的物质，即抗原 (Antigen，Ag)。
2. 特性
(1)免疫原性( immunogenecity) (2)抗原性(antigenicity) 又称免疫反应性 (immunoreactivity)
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3、半抗原性免疫原的制备
化学法：
半琥珀酸盐法 混合酸酐法 含有羧基或酚羟基的半抗原可以在三级胺存在下与氯甲酸 异丁酯反应，产生活性中间体混合酸酐，再与蛋白载体上 的伯胺基反应，形成酰胺交联键
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3、半抗原性免疫原的制备
化学法： 高碘酸钠法 某些带羰基的半抗原可以通过高碘酸钠的氧化作 用形成带双醛基的化合物，再与载体表面的氨基 偶联形成含Schiff 碱的共价结构的完全抗原
1、4℃保存（6个月） 2、低温保存（-70 ℃ ～-20 ℃ ，5年） 3、真空干燥保存（5 ～ 10年） 注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）
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实验一、 BSA抗血清制备
目的要求：掌握免疫原和佐剂的制备方法；熟悉免疫血清 制备的基本过程。 原理：将抗原物质经适当途径，按照预先制定的免疫方案 免疫动物，经过一定时间，可刺激机体产生高效价特异性 抗体并分泌到血液中，当血中抗体达到预定效价时便可采 血，分离血清，低温保存备用，即抗血清。因抗原具有多 种表位，可激活多个克隆的B 细胞活化增殖分化产生抗体， 因此，又称为多克隆抗体。 优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的质量和免疫原性， 动物应答能力以及免疫程序（免疫途径、剂量、注射次数、 时间间隔、有无佐剂等）
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实验一、 BSA抗血清制备
材料：
1. 动物：BALB/C小鼠
2. 抗原：BSA（2mg/mL） 3. 试剂：佐剂、生理盐水、75%酒精 4. 器材：小剪刀、镊子、无菌注射器（1ML）、一次性手 套，50ML离心管、酒精灯，打火机，记号笔、加样枪 （1000，200，50，10ul）、吸头（1000，200，10ul）， 2ML离心管、250ML烧杯； 均质机（乳化抗原用）
半抗原（hapten）： 载体（carrier）： 蛋白质类：BSA\OVA\KLH 多肽聚合物：多聚赖氨酸、多聚谷氨酸 大分子有机化合物：聚羟甲基纤维素、乳胶、炭末。
载体：本身是一种抗原，它们进入体内，可发挥致敏作用，激 活免疫系统，从而使半抗原也可以刺激机体产生抗体，另外半 抗原与载体结合后，可适当延迟其降解和排出体外，从而可以 发挥更久的作用。
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实验一、 BSA抗血清制备
方法 1.抗原制备：BSA (2mg/mL) 配制：与佐剂等量混合，乳化30-60分钟，取一滴于 冷水面上，不散开者达到“油包水”合格要求。
2. 免疫动物：
免疫日期 抗原 途径 剂量
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一免 BSA-FCA 腹腔/足垫 100Ug
二免 BSA-FIA 腹腔/足垫 100Ug
实验设计：
小鼠抗青霉素免疫血清的制备。
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jxgykj@163.com Leabharlann Baiduxgykj-163
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B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞产 生的与相应抗原能够特异性结合的糖蛋白。又 称免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)
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多克隆抗体（polyclonal antibody）
指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的
多种抗体混合物。
A
BA L B /c
B
C 单克隆抗体
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3. 表 位 （ epitope ） 或 抗 原 决 定 簇 （ antigenic determinant）是指存在于抗原分子中决定抗原特异 性的特殊化学基团。其性质、数量和空间构象决定 了抗原的特异性。
表位是免疫细胞识 别的标志及免疫反 应具有特异性的物 质基础。
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抗体(antibody，Ab)
三免疫 BSA 腹腔 30－50Ug
实验一、 BSA抗血清制备
3. 试血
尾部采血
4. 效价测定 琼脂扩散：1：16 ELISA： 1：2000 5.采血：眼球采血、心脏采血
6.分离血清：
一般采血后放37摄氏度一小时，然后放4度过夜。血清较少时可以离心 （1500~3000 rpm，10分钟） LOGO