藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)

藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定(实验教案)
藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。

其分子质量在 40 ku 左右 ,由α、β两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。

肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。

天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ) 6的形式存在。

与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( αβ) 3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。

分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm 具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A 620 / A 280表示其纯度。

因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。

藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。

一、教学目的
通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。

整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。

有利于培养学生的学习兴趣。

二、实验方案
1材料与方法
1. 1 实验材料
钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。

1. 2 分析方法
1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定
方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】
用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在:
方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。

藻蓝蛋白( PC)在 620 nm 处有最大光吸收,其含量测定参考王广策等人的相关研究方法:
6201425.0A c PC = (1’)
【王广策, 周百成, 曾呈奎. 钝顶螺旋藻 c-藻蓝蛋白和多管藻R-藻红蛋白的分离及其摩尔消光系数的测定[J ].海洋科学1996 , 20 (1) : 52255.】
1.2.2藻蓝蛋白的纯度测定【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】
最大光吸收在650 nm ,
式(1) - (2)PC APC 620和 A 650分别代表波长在 620 和 650 nm 处的吸光度。

【Kaplan D , Calvert H E , Peters G A. The azolla-anabaena azollae relationship. Ⅻ: Nit rogenase activity and phycobiliproteins of the endophyte as a function of leaf age and cell type[J ] . Plant Physiol , 1986 , 80 (4) : 8842890.】
1.2.3 藻蓝蛋白提取得率的计算 【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】 藻蓝蛋白提取得率(T)为提取液中藻蓝蛋白的重量与原料重量的比值。

按公式(2)计算:
10034
.5)474.0(650620⨯-=A A nV T (3) 式中: n ——样品稀释倍数;V ——提取液总体积, mL;G ——原料质量, mg 。

1.2.4 总蛋白质测定
方法一：采用考马斯亮蓝法【李冰等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化新工艺，海洋科学，2007 年，第31 卷，第8 期，48-52】取洁净干燥的试管分成两组按表1进行操作。

标准蛋白质溶液质量浓度为500 mg/ L。

以1-6号管标准蛋白质质量浓度(g/ L)为横坐标, 1-6号管A595 nm值为纵坐标作图,即得标准曲线。

未知浓度的 1∶100倍稀释后按照7-样和8-样操作测定,根据 A595值推算出浓度大小。

1. 3 藻蓝蛋白的提取分离
1. 3. 1 螺旋藻细胞的破碎和藻蓝蛋白粗提液的制备
螺旋藻细胞悬浮液：准确称取 1.0～2.0 g 螺旋藻粉 ,加入 200 mL 的pH = 7. 0、 0. 01 mol/ L 的磷酸缓冲液, 4 ℃分别浸泡 24h备用。

细胞破碎：（选择冻融法或超声波法）
方法一（冻融法）：取上述螺旋藻悬浮液在-20℃和30℃反复冻融(3次)使藻体细胞破碎,在显微镜下观察计数细胞破碎率在 90 %以上即可。

方法二（超声波法）：取上述螺旋藻悬浮液进行超声波破碎，破碎条件：功率500W，能量80%，室温，开3秒停2秒，破碎时间2～X分钟（5分钟）,在显微镜下观察计数细胞破碎率在 90 %以上即可。

离心分离：将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于 8000 r/ min 离心 15 min ,收集上清液可得到含藻蛋白的粗提液。

在 568、620和650 nm处测粗提液的吸光度,计算藻蓝蛋白的含量。

1. 3. 2 沉淀分离藻蓝蛋白
1.3.
2.1盐析法沉淀藻蓝蛋白
（1）藻蓝蛋白盐析曲线的制作（需要藻蓝蛋白粗提液40～50 ml，选做）
a.取6支干净试管编号1～6，分别加入粗提液5 ml；
b.分别向1～4号试管中加入饱和硫酸铵2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分别加入蒸馏水3 ml、2 ml 、
1 ml、0 ml；向5号、6号试管中分别先加入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5 ml，充分摇晃溶解完全后，硫酸铵饱和度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%，每管各取5ml×2混匀的溶液装入7ml×2离心管中，对应编号1-1’～6-6’，室温（或0℃）静置4h以上，对称放入离心机中，10 000 r/min ，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。

c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1 mol/L（pH7.0）磷酸缓冲溶液溶解沉淀物；
d.测定各管中总蛋白质的浓度、藻蓝蛋白浓度和纯度。

e.以硫酸铵饱和度为横坐标，总蛋白质浓度和藻蓝蛋白的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和藻蓝蛋白盐析曲线。

（2）藻蓝蛋白盐析沉淀分离
在装有固定体积藻蓝蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(NH4)2SO4溶液 ,边加边搅拌 ,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性 ,最终(NH4)2SO4溶液的质量浓度分别为50%,室温（或0℃）静置4h以上，使藻蓝蛋白盐析沉淀,再于冷冻（- 4℃）离心机中以10 000 r/ min离心20 min ,将离心得到的沉淀用 1/ 4 上清液体积的0.1 mol/L(pH=7. 0)磷酸缓冲液溶解,并倾倒于透析袋中 ,再置于去离子水中透析 24 h (每隔4 h 更换一次去离子水) ; 透析结束后 ,再于冷冻（- 4℃）离心机中，以10 000 r/ min离心 20 min ;收集上清液，在280、620 和650 nm下测吸光度 ,计算藻蓝蛋白的含量。

1. 3.
2.2 等电点法沉淀藻蓝蛋白（选做）
在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0.1 mol/ L稀H2SO4溶液 ,边加边搅拌 ,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性 ,将藻蛋白粗提液 pH调节为4.0,即藻蓝蛋白的等电点附近 ,静置过夜 ,于冷冻（- 4℃）离心机中，以10 000 r/ min 离心20 min ;将离心得到的沉淀用 1/ 4 上清液体积的0.1 mol/L(pH=7.
0)磷酸缓冲液充分溶解 ,再于冷冻（- 4℃）高速离心机中以10 000 r/ min离心20 min ;取上清液,在 280、620和650 nm下测吸光度 ,计算藻蓝蛋白的含量。

1. 3. 4 Sephadex G-200色谱纯化
选用φ15×600～800mm Sephadex G-200色谱柱，加样量为 3～5mL （约含蛋白60～100mg ）用 20mmol/L （pH 为7.0 ）的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度可控制为 0.5mL/min 即10min/管，可用 A280 的紫外线进行检测。

如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，需要稀释后测量，测量方法如下：每管取 0.5mL 稀释 10 倍后用紫外线测量的结果。

以A280测量值为纵坐标，收集管号为横坐标绘制洗脱曲线，收集藻蓝蛋白洗脱峰，取适当浓缩后进行蛋白质纯度的鉴定。

剩余部分测量体积，置于冻干管中冷冻干燥（纯品藻蓝蛋白）。

【取5mL 藻蓝蛋白收集液留作藻蓝蛋白含量测定和纯度分析】
1. 3. 5藻蓝蛋白的收率和分离因数
分别计算藻蓝蛋白的收率( Y) 、 浓缩率( m)和分离因数(β ) :
N PC Y t /][= (4)
][][PC PC m t = (5)
00]/[][]/[][]/[][PE PE ACP ACP PC PC t t t +=
β (6) 式(4) - (6)中 , N ( g/ L)为藻液比, 0 和 t 分别代表冷冻-融化后藻蛋白粗提液和经过盐析法沉淀或等电点法沉淀最终得到的藻蓝蛋白上清液。

1.4 藻蓝蛋白的稳定性试验
1.4.1 温度稳定性试验
将 1. 3. 2 中富集分离得到的藻蓝蛋白上清液分别置于 20、 30、 40 和 50 ℃的水浴中 ,开始计时并每隔0. 5 h 测量上清液在 568、 620 和 650 nm 处的吸光度 ,再采用 1. 2 中的分析方法测量藻蓝蛋白的浓度 ,以考察藻蓝蛋白对温度的稳定性。

1.4.2酸碱稳定性试验
将 1. 3. 2 中富集分离得到的藻蓝蛋白上清液用0. 1 mol/ L 稀 H 2SO 4 溶液调节pH 为 3. 0、 5. 0、
8. 0和 9. 0 ,置于 20℃ 的水浴中 ,开始计时并每隔0. 5 h 测量上清液在568、 620 和650 nm 处的吸光度 ,再采用 1. 2 中的分析方法测量藻蓝蛋白的浓度 ,以考察藻蓝蛋白对酸碱的稳定性。

1.5 PC 纯度分析
1.5.1测定各级分离提纯程序
1.5.1
2.结果与讨论
1、蛋白质标准曲线；
2、藻蓝蛋白盐析曲线；
3、藻蓝蛋白Sephadex G-200柱层析图谱
4
5集分离的影响；8、藻蓝蛋白对温度的稳定性；9、藻蓝蛋白的酸碱稳定性 3 结论
研究表明: 1、2、3、4、… … … … ……
参考文献:。