8 第八讲(3) 植物单细胞培养技术

3.3 微室培养法
程 序： 1 借助于微型移液管从 细胞悬浮液中提取适量单 细胞悬浮液 ，置于一张无 菌载片上。在这滴培养液 四周与之隔一定距离加上 一圈石蜡油，构成微室的 ”围墙”，在围墙左右两 侧再各加一滴石蜡油，每 滴之上置一张盖片作为微 室的“支柱”。
3.3 微室培养法
程 序： 2 将第三张盖片架在两个“支 柱”之间，构成微室的“屋 顶” 3 单细胞悬浮液在微室中
3.1 平板培养法
程 序： 2 单细胞悬浮液的密度调整
要求：调整后的密度为植板细胞密度的2倍 调整方法：①如果密度过大，加入液体培养基进行 稀释； ②如果密度小，通过低速离心使细胞沉 降后，再加入适量液体培养基。
3.1 平板培养法
程 序： 3 固体培养基的配制
当细胞植板密度过高(104或105个/ml)，使用和 在悬浮培养中或愈伤组织培养中成分相似的纯合 成培养基 当细胞植板密度过小，细胞对培养基的要求 就变得越加复杂 注意：要选择适合单细胞培养的培养基
植物单细胞培养技术
周口师范学院生命科学系
1 植物单细胞培养的意义
1.1 有利于观察细胞个体的分裂、分化、生长和繁 殖情况； 1.2 有利于获得纯细胞系； 1.3 有利于进行细胞特性、细胞生长规律、细胞代 谢过程及其调节控制规律等方面的研究； 1.4 有利于生物转化和天然化合物的生产。
2 植物单细胞的分离技术
3.2 看护培养法
程 序： 3 借助于微型移液管从细胞 悬浮液中提取适量单细胞 悬浮液 ，然后接种在无菌 滤纸上面。 4 将在滤纸上由单细胞形成的 细胞团转移到新鲜的固体培 养基中进行继代培养，获得 由单细胞形成的细胞系。
为什么有愈的存在给单细胞传递了某些生物信息 2 愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件
原因是什么？
？
初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响
原因： 植物细胞的生长繁殖需要一定浓度的某些内 源化合物。
初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响
如何培养完全孤立的单细胞？
？
3.2 看护培养法
程 序： 1 将生长活跃的愈伤组织接 种在固体培养基上
2 在愈伤组织块上方放置一 片面积为1cm2的无菌滤纸， 滤纸下方紧贴愈伤组织
3.1 平板培养法
程 序： 4 单细胞悬浮液与固体培养基等量混合
①当培养基凝固后，细胞能均匀的分布并固定在很 薄一层(1mm)培养基中 ②在培养皿外对单细胞做标记，便于观察。
3.1 平板培养法
程 序： 5 暗培养
注意： 培养期间对细胞频繁的镜检会对细胞的生 长产生有害作用，应尽量减少镜检次数。
3.1 平板培养法
3.3 微室培养法（1960年，Jones）
3.1 平板培养法
程 序：
1 单细胞悬浮液的制备 2 单细胞悬浮液的密度调整
4 单细胞悬浮液与固体 培养基等量混合
3 固体培养基的配制
5 暗培养
6 继代培养
3.1 平板培养法
程 序： 1 单细胞悬浮液的制备 单细胞来源： 外植体(叶肉细胞) 愈伤组织 原生质体
程 序： 6 继代培养
选取生长良好的由单细胞形成的细胞团，可 以获得由单细胞形成的细胞系。
初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响
用平板法培养单细胞或原生质体时，常以植板效率 来表示 。
植板效率=每个平板上形成的细胞团数/每个平板上接种的细胞总 数×100%
如果在琼脂培养基或液体培养基中，植板细胞的 初始密度为1 ×104或1 ×105个/ml，植板后由相邻细 胞形成的细胞群落常混在一起。 如果降低植板密度或完全孤立地培养单细胞，则 可避免这个问题。但是当低于临界密度时，细胞就不 能分裂。
2.1 从外植体直接分离单细胞 2.2 从愈伤组织分离单细胞 2.3 通过原生质体再生法获得单细胞
2.1 从外植体直接分离单细胞 外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经 过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮 液。 悬浮液中所含的完整细胞数量较少，但 分散性好。
2.2 从愈伤组织分离单细胞
将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细 胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残 渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 为了增强分散效果，必要时可添加适量的果胶酶，使由果 胶粘连在一起的细胞分开。
2.3 通过原生质体再生法获得单细胞
外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶 等的作用，除去细胞壁而获得原生质体。
外植体 愈伤组织
酶解
原生质体 再生细胞壁
再生植株
愈伤组织
单细胞悬浮液
3 植物单细胞的培养方法
3.1 平板培养法（1960年，Bergman）
3.2 看护培养法（1954年，Muir ）
小 结：
通过这一节课 的学习，我们要掌握的知识点： 1 植物单细胞的获得方法 2 植物单细胞的培养技术
思考：
1 简述植物单细胞平板培养操 作过程 2 在进行植物单细胞培养时， 细胞密度过大或过小会对 培养结果产生什么影响？
4 当细胞团长到一定大小时揭 掉盖片，把细胞团转移到 新鲜培养基上培养
微室培养图示：
凹穴载玻片
1滴含单细胞培养 液
周围加石蜡油
旁边加石蜡油
盖盖玻片
盖盖玻片
平视图
置培养皿中26～28 ℃ 恒温培养
微室培养的优点： ①有利于对细胞特性的研 究 ②有利于对单个细胞的生 长、分裂、分化等情况进行 全程跟踪研究。