马铃薯晚疫病菌的分离纯化和单孢分离

马铃薯晚疫病菌的分离纯化和单孢分离

包海银

甘肃农业大学草业学院，兰州（730070）

摘要：晚疫病是马铃薯上最严重的真菌病害，它普遍发生于马铃薯的产区，引起马铃薯晚疫病的致病疫霉很难分离培养并得到纯菌株，本文对采自临洮不同海拔、不同品种马铃薯晚疫病病叶进行致病疫霉菌的分离纯化和单孢分离，为马铃薯晚疫病菌的进一步研究提供试验材料。

关键词：马铃薯晚疫病菌，分离，纯化，单孢分离

马铃薯晚疫病(Phytophthora infestans)是全球马铃薯生产中毁灭性病害，是所有引起粮食作物产量损失的病害中最严重的一种真菌性病害, 全球每年因此病害造成的直接经济损失达170 亿美元以上[1]。我省马铃薯产区都有发生，陇南和中部的阴湿二阴地区最重，只要7-9月降雨频繁，晚疫病必定大流行。六十年代初期，每年该病损失薯块占总产量的15%，1966年后，由于推广了比较抗病的品种，使该病得到了长期控制。但近年来，由于一些抗病品种退化，在阴湿多雨地区，该病又开始流行。

P. infestans存在A1、A2两种交配型，在寄主上通常以无性生殖方式繁殖。A2交配型1980年以前仅在墨西哥中部发现，世界其它各地只有A1交配型分布。但在后来的10-15 年中，A2交配型在世界各地包括欧洲、亚洲、南美洲、北美洲等相继发现。我国南北方也均已发现A2交配型的存在[2]，因此80年代后，新的晚疫病原小种已经逐步取代了原有A1交配型生理小种，产生毒性更强的小种。A1、A2交配型的有性重组产生的卵孢子具有能忍耐不良环境、存活时间长的特点，有可能成为生命力更强，能够摆脱活体薯块存在的新的病源，这将为晚疫病防治带来更大困难。

马铃薯晚疫病主要靠化学药剂进行防治，常用的药剂是瑞毒霉，但自1980年后在荷兰、爱尔兰和其它欧洲国家、美洲及中东等地区也相继发现了抗性菌株发现抗的晚疫病菌株，对我国马铃薯主产区晚疫病菌株抗药性试验表明，90年代后期使用过瑞毒霉的地区普遍存在抗药性菌株。

对马铃薯晚疫病菌进行分离纯化以及单游动刨子无性系的建立，在遗传上获得较均一的单孢菌株，对疫霉菌的生理生化、抗药性的监测和遗传研究是一项十分有用的技术。据报道，从一个孢子囊中获得分离物能明显地分为三个不同的生理小种，从而证明了游动孢子的异核性，马铃薯晚疫病菌游动孢子的多核性在病原菌寄生变异中有很大意义，异质核能决定产生特异性的新菌系，虽然研究人员报道不同游动孢子的多核性，但人们普遍认为单游动孢子基本上是单核的。所以，在晚疫病菌遗传学和分子生物学以及交配型测定中，为了试验更高的准确性和重复性，最好应选用遗传性状单一的单游动孢子分离物作为实验材料。

本文对采自临洮不同海拔、不同品种马铃薯晚疫病病叶进行致病疫霉菌的分离纯化和单孢分离，为马铃薯晚疫病菌的进一步研究提供试验材料。

1 材料与方法

1.1供试材料：

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以采自临洮不同海拔、不同品种马铃薯病叶为试验材料。

1.1.1 供试培养基

黑麦培养基的制备：

黑麦60g，琼脂20g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml。

取60g黑麦在1000ml蒸馏水中浸泡24～36小时，在121℃下高压灭菌30分钟。

捣碎后经4层纱布过滤去渣，上清液补足1000ml，加入琼脂、蔗糖在121℃下高压蒸汽灭菌。

选择性培养基的制备[3]：

在适合于疫霉菌生长的培养基中加入少量可以抑制其他真菌和细菌生长，而对疫霉菌生长抑制不大的抗生素和杀菌剂配置而成的培养基。

每100ml培养基中加入利福平20mg，50%三氯硝基苯20mg，氨苄青霉素10mg。

在待培养基温度下降至50～60℃时，加入所用的药物摇匀，即刻倒平板使用。抗生素和杀菌剂可以配制成母液，在4℃冰箱中保存。

1.2 试验方法

1.2.1 分离和纯化[4]

将采集的新鲜病组织在自来水龙头上用缓慢流水冲漂24-36小时，稍晾干。选病健交接处组织切成2×2mm 左右大小。

将易感病的马铃薯表面消毒后切成片，置于放有滤纸的培养皿中，倒入无菌水保持湿润。

将切好的病组织置于马铃薯片上，在20℃温箱中培养数日。

待菌落形成以后，将培养皿底朝上置于低倍显微镜下观察，若分离物的菌丝无隔膜，从菌落边缘移出菌丝块。

将移出的菌丝小心转接到选择性培养基纯化，待再次长出菌落后，在显微镜下直接观察鉴定。进一步观察孢子囊并诱导产生游动孢子进行鉴定。

1.2.2 单孢分离[5]

将供试菌株在黑麦培养基的平板上培养8d，用无菌水冲洗后，再用尼龙网过滤除去菌丝，滤液放在灭菌的三角瓶中。

将其置于4℃冰箱中2～3h 以刺激游动孢子释放，然后再用钢丝网过滤除去孢子囊和空孢子囊壳。

用血球计数器将滤液中的游动孢子浓度调至80～160 个/mL，用微量移液器取2μL 游动孢子悬浮液滴于灭菌的载玻片上，在超净工作台上用显微镜（10×10）镜检两遍，肯定该滴悬浮液仅含有1 个游动孢子。

换另一个灭菌的枪头将这1 滴游动孢子悬浮液转移到黑麦培养基平板上。8-20d 后在平板上长出的单个菌落即是单游动孢子分离物菌落。

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2 结果与分析

2.1 分离纯化的结果

经菌丝形态和孢子囊及游动孢子鉴定，本试验获得不同海拔、不同寄主品种的4个菌株，分别为LT1-9、LT3-3、LT4-1、LT4-3，均为单病斑分离物，培养基内的疫霉菌菌丝无隔膜，较粗壮，多分枝，主干不明显，通常清晰可见。孢子囊梨形，大小28.74～26.72×17.76～18.83μm。

2.2单孢子分离结果

采用上述单孢子分离方法，用两个单病斑菌株LT1-9和LT4-3，共分离了20个单游动孢子，其中得到了11个单游动孢子分离物，成功率为55%

表1单游动孢子分离百分率

Table1 Percentage of single-zoospore isolation

菌株编号单孢子分离数分离物数单孢子分离率

Isolates Number of single-zoospore Number of single-zoospore

Percenta

ge of

single-z

oospore

I

Isolation cultures

isolation

(%)

LT1-9 10 7 70

LT4-3 10 4 40

3 讨论

单孢分离是植物病理学的基本技术，它可纯化病原菌，是进行病原鉴定、生理生化、病菌遗传变异等方面研究的基础[6]。单孢分离的方法很多，常采用平板划线法。但这种方法不太适用于马铃薯晚疫病菌，因为：（1）市售琼脂杂质较多，经高压灭菌后仍可保留许多不规则的小块，在显微镜下观察时，这些小块不但直接影响观察，而且与马铃薯晚疫病菌的游动孢子囊比较相似，给单孢分离带来困难，加之游动孢子较小，如果进行单个游动孢子的分离则更困难；（2）马铃薯晚疫病菌较难培养，即使在适宜的培养基（如利马豆、v8汁等）上，单个游动孢子或游动孢子囊也难以形成菌落；（3）用镊子挑取小块培养基较难操作，且易使培养基破碎，很难再保证单孢分离。

分离疫霉菌的目的是获得疫霉菌的纯培养，是研究疫霉菌和植物疫病的最基本技术。采用分离真菌的常规方法分离疫霉菌不容易成功，主要是由于疫霉病组织中常有杂菌如腐霉菌，镰刀菌，丝核菌及某些接合菌混生[7]。这些真菌较疫霉菌迅速，抑制了疫霉菌生长

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