环境内分泌干扰物的检测
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Nhomakorabea 检测方法
• 检测卵黄蛋白原的方法有多种, 常用的有3 种: 放射性免疫测定法(R IA )、酶联免疫法 (EL ISA ) 和蛋白吸印免疫检测法(W estern B lo t t ing)。
检测方法
• 放射性免疫测定法：使用[ 32P ]和[ 3H ]标 记的亮氨酸; 对不同鱼种类都有效; 灵敏、 定量、特异性; 灵敏检测限为0.001 µmol/mL , 常规检测限为0.01 µmol/mL • 酶联免疫法：使用单克隆或多克隆抗体;不 同鱼种类有特异性; 在适当的稀释范围也允 许定量; 检测限为0.1 µmol/mL • 蛋白吸印免疫检测法：能准确确定蛋白质, 但定量方面较弱
• 环境中大量存在的内分泌干扰物可能危害 人类和野生动物内分泌、神经、免疫等系 统的正常功能并导致内分泌紊乱、生长发 育异常、出生缺陷和肿瘤的发生率增加、 生殖能力下降等，从而严重影响人类的生 存与发展。 • 国内率先开始研究的是1997年中国科学院 生态环境研究中心环境水质学国家重点实 验室。
目的和意义
环境内分泌干扰物的 雌激素效应检测
内分泌干扰物简介
• 内分泌干扰物：天然动物性雌激素雌酮(E1)、 雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和作为药物使用的人 工合成雌激素己烯雌(DES)、乙炔基雌二醇 (EE2)、戊酸雌二醇(EV)。 • 分子结构 具有苯环结构的居多, 分子量150～ 400之间。分子结构和分子大小与生物体内的 激素相似。 • 性质 大多数是脂溶性化合物, 分子中不含有 强的水溶性基因, 因此较易溶于油脂类物质中, 水中溶解度较小。性质比较稳定，具有难分解 性, 不易生物降解, 可通过食物链进入体内并富 集。
实验鱼种
• 目前已经有资料表明选用的鱼类主要有以 下几种: 鲤科(carp)、鲽类(flounder)、罗非 鱼( tilapia)、日本青鳉(Japane semedaka)、 大西洋鲑(Atlantic salmon)、虹鳟( rainbow trout)、呆头鲦(fatheadm innows)、剑尾鱼 ( swordtail fish ) 和白鲑(chub)。由于不同的 鱼种类自身的生物学特点不同, 所以就决定 了不同的环境激素类物质一般要选用不同 的鱼种进行检测。 • 我们实验室选用的是日本青鳉
反应式及计算公式
OD 420 OD420 U D t V OD 600
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酵母双杂交法
• 重组基因酵母法仅仅把人类雌激素受体 (hER) 的DNA片段整合到酵母的基因组中; 而酵母双杂交法则在此基础之上, 把辅激活 蛋白同时转入酵母细胞中。
雌激素浓度的分析
• 雌激素效应的检测是有利于对其浓度的检 测，通过检测其效应，判断环境水里的雌 激素分布，然后对每一物质进行浓度检测 • 对其浓度的分析而达到对水域的生态风险 评估
重组基因酵母检测法
• 原理：酵母细胞一般不含雌激素受体(ER )。重组基因酵 母检测法是将人类雌激素受体(hER) 的DNA 片段整合到 酵母基因组中的雌激素应答表达子(ERE) 质粒上。这个表 达质粒上还带有能编码β-半乳糖苷酶的报告基Lac2Z。在 这个系统中,hER 以一种能够与ERE 结合的形式被表达。 ERE序列位于表达质粒上的一个强启动子序列之中。在结 合一个活性配体之后, 与雌激素结合的受体就会与转录因 子和其他转录成分反应来调节基因的转录, 这就引起了报 告基因Lac2Z 的表达,产生的β-半乳糖苷酶就会分泌到介 质中(图1)。在介质里, β-半乳糖苷酶使能发色的酶作用物 β-D-吡喃半乳糖苷氯酚红(CPRG, 通常为黄色) 产生代谢 变化, 变成红色, 能在540nm测吸光率。通过检测β-半乳糖 苷酶的量就可以定量检测出化学品的类雌激素活性。
• 本研究目的在于了解水体中内分泌干扰物 DES、E1、E2、EE2、E3和EV 6种雌激 素的存在及含量，以期为该类物质的进一 步生态风险评价提供基础数据
研究方法
• 鱼类卵黄蛋白原诱导实验法 • 重组基因酵母检测法 • 酵母双杂交法
鱼类卵黄蛋白原诱导实验法
• 原理：卵黄蛋白原(vitellogenin) 是存在于性成熟 卵生脊椎动物血清中的一种糖脂磷蛋白，是一种 雌性特有的血清蛋白，已被确认是大多数卵生脊 椎动物的卵黄前体物质。 • 雄性个体和幼体在大剂量的人工雌激素作用下， 以及在低剂量的类雌激素长期作用下，都能诱导 体内卵黄蛋白原的生成。卵黄蛋白原作为鱼类等 卵生动物雌激素的一种生物标志物，这种方法不 仅可以检测类雌激素物质，而且可通过其代谢检 测类雌激素物质的前体物质。
• 检测卵黄蛋白原的方法有多种, 常用的有3 种: 放射性免疫测定法(R IA )、酶联免疫法 (EL ISA ) 和蛋白吸印免疫检测法(W estern B lo t t ing)。
检测方法
• 放射性免疫测定法：使用[ 32P ]和[ 3H ]标 记的亮氨酸; 对不同鱼种类都有效; 灵敏、 定量、特异性; 灵敏检测限为0.001 µmol/mL , 常规检测限为0.01 µmol/mL • 酶联免疫法：使用单克隆或多克隆抗体;不 同鱼种类有特异性; 在适当的稀释范围也允 许定量; 检测限为0.1 µmol/mL • 蛋白吸印免疫检测法：能准确确定蛋白质, 但定量方面较弱
• 环境中大量存在的内分泌干扰物可能危害 人类和野生动物内分泌、神经、免疫等系 统的正常功能并导致内分泌紊乱、生长发 育异常、出生缺陷和肿瘤的发生率增加、 生殖能力下降等，从而严重影响人类的生 存与发展。 • 国内率先开始研究的是1997年中国科学院 生态环境研究中心环境水质学国家重点实 验室。
目的和意义
环境内分泌干扰物的 雌激素效应检测
内分泌干扰物简介
• 内分泌干扰物：天然动物性雌激素雌酮(E1)、 雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和作为药物使用的人 工合成雌激素己烯雌(DES)、乙炔基雌二醇 (EE2)、戊酸雌二醇(EV)。 • 分子结构 具有苯环结构的居多, 分子量150～ 400之间。分子结构和分子大小与生物体内的 激素相似。 • 性质 大多数是脂溶性化合物, 分子中不含有 强的水溶性基因, 因此较易溶于油脂类物质中, 水中溶解度较小。性质比较稳定，具有难分解 性, 不易生物降解, 可通过食物链进入体内并富 集。
实验鱼种
• 目前已经有资料表明选用的鱼类主要有以 下几种: 鲤科(carp)、鲽类(flounder)、罗非 鱼( tilapia)、日本青鳉(Japane semedaka)、 大西洋鲑(Atlantic salmon)、虹鳟( rainbow trout)、呆头鲦(fatheadm innows)、剑尾鱼 ( swordtail fish ) 和白鲑(chub)。由于不同的 鱼种类自身的生物学特点不同, 所以就决定 了不同的环境激素类物质一般要选用不同 的鱼种进行检测。 • 我们实验室选用的是日本青鳉
反应式及计算公式
OD 420 OD420 U D t V OD 600
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酵母双杂交法
• 重组基因酵母法仅仅把人类雌激素受体 (hER) 的DNA片段整合到酵母的基因组中; 而酵母双杂交法则在此基础之上, 把辅激活 蛋白同时转入酵母细胞中。
雌激素浓度的分析
• 雌激素效应的检测是有利于对其浓度的检 测，通过检测其效应，判断环境水里的雌 激素分布，然后对每一物质进行浓度检测 • 对其浓度的分析而达到对水域的生态风险 评估
重组基因酵母检测法
• 原理：酵母细胞一般不含雌激素受体(ER )。重组基因酵 母检测法是将人类雌激素受体(hER) 的DNA 片段整合到 酵母基因组中的雌激素应答表达子(ERE) 质粒上。这个表 达质粒上还带有能编码β-半乳糖苷酶的报告基Lac2Z。在 这个系统中,hER 以一种能够与ERE 结合的形式被表达。 ERE序列位于表达质粒上的一个强启动子序列之中。在结 合一个活性配体之后, 与雌激素结合的受体就会与转录因 子和其他转录成分反应来调节基因的转录, 这就引起了报 告基因Lac2Z 的表达,产生的β-半乳糖苷酶就会分泌到介 质中(图1)。在介质里, β-半乳糖苷酶使能发色的酶作用物 β-D-吡喃半乳糖苷氯酚红(CPRG, 通常为黄色) 产生代谢 变化, 变成红色, 能在540nm测吸光率。通过检测β-半乳糖 苷酶的量就可以定量检测出化学品的类雌激素活性。
• 本研究目的在于了解水体中内分泌干扰物 DES、E1、E2、EE2、E3和EV 6种雌激 素的存在及含量，以期为该类物质的进一 步生态风险评价提供基础数据
研究方法
• 鱼类卵黄蛋白原诱导实验法 • 重组基因酵母检测法 • 酵母双杂交法
鱼类卵黄蛋白原诱导实验法
• 原理：卵黄蛋白原(vitellogenin) 是存在于性成熟 卵生脊椎动物血清中的一种糖脂磷蛋白，是一种 雌性特有的血清蛋白，已被确认是大多数卵生脊 椎动物的卵黄前体物质。 • 雄性个体和幼体在大剂量的人工雌激素作用下， 以及在低剂量的类雌激素长期作用下，都能诱导 体内卵黄蛋白原的生成。卵黄蛋白原作为鱼类等 卵生动物雌激素的一种生物标志物，这种方法不 仅可以检测类雌激素物质，而且可通过其代谢检 测类雌激素物质的前体物质。