产KPC-2肺炎克雷伯菌的基因分型、毒力基因和血清型特征研究

产KPC-2肺炎克雷伯菌的基因分型、毒力基因和血清型特征
研究
程莉;曹小利;沈瀚;张之烽;宁明哲;周万青;张葵
【摘要】目的分析我院产KPC-2肺炎克雷伯菌基因分型、毒力基因和血清型特点.方法收集碳青霉烯类不敏感肺炎克雷伯菌菌株75株(采用改良Hodge试验和DNA测序以确定其表型和基因型)和同期分离的敏感株97株,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株间的同源性,PCR检测9种毒力基因allS、rmpA、mrkD、kfuBC、cf29a 、fimH、uge、wabG、ureA和K1、K2、K5、K54、K57、K206种血清型.比较产KPC-2和非产KPC-2肺炎克雷伯菌的毒力基因和血清型差异.结果 75
株碳青霉烯类不敏感肺炎克雷伯菌菌株中,有61株细菌经改良Hodge试验初筛为产碳青霉烯酶菌株,PCR扩增及DNA测序确定其为产KPC-2酶.PFGE结果显示,依据相似度80％的折点,产KPC-2酶组的61株细菌来源于30个克隆菌株,不产
KPC-2酶组的111株肺炎克雷伯菌来源于96个克隆菌株.allS基因在不产KPC-2
组中的阳性率(21.9％)高于在产KPC-2组的阳性率(3.3％),差异有统计学意义(P＜0.05).血清型K1、K2和K54在产KPC-2组与不产KPC-2组间的分布差异无统计学意义(P＞0.05),其他3种血清型未检测到.结论产KPC-2肺炎克雷伯菌临床分离株携带的尿素酶基因allS减少,且大多不属于高致病性血清型,但作为高度耐药菌,应加强监控.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2015(033)008
【总页数】5页(P591-595)
【关键词】KPC-2;毒力基因;血清型;脉冲场凝胶电泳;肺炎克雷伯菌
【作者】程莉;曹小利;沈瀚;张之烽;宁明哲;周万青;张葵
【作者单位】南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏210008;南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏210008
【正文语种】中文
【中图分类】R446.5
肺炎克雷伯菌是常见的医院和社区获得性感染的机会性致病菌，可导致尿路感染、肺炎、败血症、脑膜炎、肝脓肿等多种感染。

随着碳青霉烯类药物在临床上的不断使用，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌不断增多，其最主要的机制在于KPC酶的产生，目前全球以KPC-2最为常见[1]。

虽然产KPC-2肺炎克雷伯菌流行广泛，但对该类菌株的毒力特点报道不多。

本研究对我院2012～2014年临床分离的产KPC-2肺炎克雷伯菌的毒力和血清型特点进行分析，旨在为临床治疗提供参考。

1.1 菌株来源收集我院2012年5月至2014年7月碳青霉烯类不敏感肺炎克雷伯菌75株，其中痰液30株，血液13株，尿液9株，分泌物7株，导管头6株，其他标本类型10株。

对照组为碳青霉烯类敏感的肺炎克雷伯菌97株，其中血液40株，尿液19株，分泌物11株，导管头5株，胆汁4株，腹水4株，痰液4株，其他标本类型10株。

所有菌株均经法国生物梅里埃ATB细菌鉴定仪或Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定仪鉴定。

纸片扩散法(K-B法)检测美罗培南和亚胺培南的敏感性，结果判读参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2015年推荐
的标准。

1.2 仪器和试剂美罗培南纸片(Oxiod公司)；PCR引物由Invitrogen公司合成；2×PCR Master Mix、PCR产物纯化试剂盒(北京天根公司)；XbaⅠ(上海生工公司)。

PCR扩增仪(上海爱普拜斯公司)，凝胶成效分析仪和CHEF-Mapper XA PFGE系统(Bio-Rad公司)。

1.3 碳青霉烯酶表型检测采用改良Hodge试验对75株碳青霉烯类不敏感的肺炎克雷伯菌进行碳青霉烯酶初筛。

其中阳性质控株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，阴性质控株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。

1.4 blaKPC的扩增和鉴定采用水煮法提取细菌基因组DNA，取2 μL上清液
作为PCR模板。

引物序列参照文献[2]。

PCR反应体系为50 μL，其中2×PCR Master Mix 25 μL，DNA模板2 μL，20 μmol/L上、下游引物各2 μL，DDW
补足体积。

blaKPC的扩增条件为：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s, 72 ℃ 50 s，36个循环；72 ℃ 5 min。

产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外成像观察
结果，PCR扩增产物送上海美吉生物公司测序。

测序结果经Chromas软件检测后，使用Blast比对、确定。

1.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析将收集的肺炎克雷伯菌包埋制成胶块，用蛋白
酶K裂解处理，并经过XbaⅠ于37 ℃酶切2 h，然后将胶块洗涤，上样，于14 ℃在GenePath电泳仪中进行电泳。

电泳完成后EB染色，凝胶成像，并将所得的图像经过Bionumerics软件进行聚类分析绘制系统树，依据Tenover等[3]提出的PFGE解释标准以及Dice系数来分析PFGE带型之间的相似度[4]，取80%为临界值比较菌株的遗传亲缘性。

1.6 毒力基因扩增根据参考文献[5]设计引物，PCR扩增检测下列9种毒力基因allS、rmpA、mrkD、kfuBC、cf29a、fimH、uge、wabG、ureA，对应退火温
度分别为50 ℃、49 ℃、46 ℃、50 ℃、55 ℃、51 ℃、55 ℃、53 ℃、53 ℃、
55 ℃。

PCR反应体系同1.4。

PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，各基因
退火温度30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸1 min。

产物经15 g/L琼脂
糖凝胶电泳后紫外成像观察结果，PCR扩增产物送上海美吉生物公司测序。

测序
结果经Chromas软件检测后，使用Blast比对、确定。

1.7 血清型分析依据参考文献[6]设计引物，用PCR对K1、K2、K5、K54、
K57、K20 6种血清型进行检测分析。

PCR反应体系同1.4。

PCR扩增条件：94 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s,58 ℃ 90 s,72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外成像观察结果，PCR扩增产物送上海美吉生物公司
测序。

测序结果经Chromas软件检测后，使用Blast比对、确定。

1.8 统计学分析用SPSS 11.0软件进行统计分析。

对于产KPC-2的肺炎克雷伯菌和不产KPC-2肺炎克雷伯菌的毒力基因分布和血清型差异使用卡方检验进行比较。

2.1 表型试验及blaKPC的检测结果改良Hodge试验发现，75株碳青霉烯类
不敏感肺炎克雷伯菌中，61株产碳青霉烯酶，经PCR和DNA测序分析发现，这61株细菌均产KPC-2酶。

2.2 PFGE结果61株产KPC-2酶的肺炎克雷伯菌中有30个克隆型，111株不
产KPC-2的肺炎克雷伯菌有96个克隆型。

见图1。

每一克隆型取1株细菌作比较，则产KPC-2酶组为30株，不产KPC-2酶组为96株。

2.3 毒力基因分布毒力基因的分布见表1、图2。

总体上，肺炎克雷伯菌临床
分离株中以毒力基因fimH和uge的流行最为广泛，阳性率分别为96.8%和
92.9%；其次为ureA和mrkD，阳性率分别为88.1%和84.9%；毒力基因cf29a
和wabG阳性率仅为1.58%和4.8%。

在产KPC-2的30株肺炎克雷伯菌中，以
毒力基因ureA、mrkD、fimH及uge的分布最为广泛，阳性率分别为96.7%、93.3%、90%和90%；而在不产KPC-2的96株肺炎克雷伯菌中，以fimH、uge、
ureA及mrkD的流行最为广泛，阳性率分别为97.9%、93.8%、85.4%及83.3%。

统计学分析发现，allS基因在不产KPC-2组中的阳性率(21.9%)高于在产KPC-2
组的阳性率(3.3%)，差异有统计学意义(χ2=5.875, P<0.05)。

2.4 血清型分布在我们所分析的6种血清型中，9株(占7.1%)为K1型，其中
1株为产KPC-2的肺炎克雷伯菌；8株(占6.3%)K54型肺炎克雷伯菌中，只有1
株为产KPC-2的肺炎克雷伯菌，携带mrkD、uge、ureA 3种毒力基因；有6株(占4.8%)细菌为K2型，全为不产KPC-2的肺炎克雷伯菌，均携带fimH基因。

统计学分析发现，血清型K1、K2和K54在两组之间的分布差异无统计学意义(P>0.05)。

其他3种血清型未检测到。

见表1、图2。

肺炎克雷伯菌的毒力因子主要有荚膜多糖(K抗原)、黏附因子、铁摄入能力、毒素性因子等[7-11]。

本研究分析毒力基因发现，除allS外，其他毒力基因在两组之
间的分布差异无统计学意义。

而与产KPC-2组的细菌相比，allS在不产KPC-2组肺炎克雷伯菌中的分布明显增高，这与Montanari等[12]提出的细菌为了获得耐
药基因以取得最佳适应性而丢弃一些毒力基因的说法相符，也与徐祥等[13]的研究结果一致，暗示产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌虽然耐药性增强，但致病力可能会较弱。

本研究中只有allS基因在产KPC-2肺炎克雷伯菌中的分布较高，作为尿素酶基因，其在产KPC-2的肺炎克雷伯菌的致病过程中作用强度等还有待于进一步研究。

荚膜多糖是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子，可以对抗嗜中性粒细胞的吞噬作用而致病，同时可介导细菌逃避和抵抗宿主的免疫杀伤[14]。

到目前为止，根据荚膜多糖结构及抗原性的不同，可将肺炎克雷伯菌分为82个血清型[15]。

而临床上比较常
见的血清型为K1、K2、K5、K20、K54、K57。

其中，K1与化脓性肝脓肿有关；K2、K5血清型与社区获得性肺炎有关[16]；K54和K57血清型与群体侵入性肝脓肿综合征相关[17]。

本研究中，我们虽然检测到K1、K2、K54 3种血清型，但大
多都分布于不产KPC-2肺炎克雷伯菌组中，而由于检测到的血清型相对较少，并
且在两组之间的分布差异无统计学意义，很难说明这种高度耐药菌的血清型情况。

而最近的一项研究发现，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的血清型主要为K64，其次为 K62、K24、KN2和K28，均不属于高致病性菌株血清型。

但其分析的86株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中，只有10株产碳青霉烯酶，其中，只有3株产KPC酶，因此难以比较分析[18]。

本研究中发现了1株产KPC-2的K1型和1株产KPC-2的K54型肺炎克雷伯菌，均为高致病性毒力菌株。

回顾病历资料发现，产KPC-2的K1型肺炎克雷伯菌感染的患者为92岁患有血管性痴呆的男性患者，有发烧、多痰等症状，胸片提示双肺纹理增多、左侧胸腔积液，结合痰培养，诊断为肺部感染，通过多种抗菌药物联合抗感染、雾化吸痰等综合治疗有所好转。

产KPC-2的K54型肺炎克雷伯菌感染的患者为45岁具有多发伤的男性患者，入院后持续发烧，血象高，全身炎症反应严重，手术后患者下肢感染严重，并发感染性休克以及伴有铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等继发性感染，后经截肢、多种抗菌药物的联合使用等抗感染措施病情才有所好转。

综上所述，K1、K54型肺炎克雷伯菌为高致病性细菌，而产KPC-2酶使得临床治疗复杂化、患者病情易反复、住院时间延长等。

总之，产KPC-2肺炎克雷伯菌临床分离株携带的尿素酶基因allS减少，且大多不属于高致病性血清型，但作为高度耐药菌，对临床治疗具有很大的挑战，应加强监控此类细菌。

【相关文献】
[1]Wei ZQ, Du XX, Yu YS. Plasmid-mediated KPC-2 in a Klebsiella
pneumoniae isolate in China[J]. Antimicrob Chemother, 2007, 51(2):763-765.
[2]Poirel L, Walsh TR, Cuvillier V, et al. Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2011, 52(12):119-123.
[3]Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al．Interpreting chromosomal DNA restriction
patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis criteria for bacterial strains
typing[J]. Clin Microbiol, 1995, 33(9): 2233-2239．
[4]Adhami EW, Roberts LA, Vickery B, et al．Epidemiological analysis of a methicillin-resistant Staphylococcus aureus outbreak using restriction fragment length polymorphisms of genomic DNA[J]. J Gen Microbiol, 1991, 137(12): 2713-2720．
[5]Brisse S，Fevre C, Passet V, et al. Virulent clones of Klebsiella pneumoniae: identification and evolutionary scenario based on genomic and phenotypic characterization[J]. PLoS One, 2009, 4(3): e4982.
[6]Turton JF, Perry C, Elgohari S, et al. PCR characterization and typing of Klebsiella pneumoniae using capsular type-specific, variable number tandem repeat and virulence gene targets[J]. J Med Microbiol, 2010, 59(5): 541-547.
[7]Chuan g Y P, Fang CT, Lai SY, et al. Genetic determinants of capsular serotype K1 of Klebsiella pneumoniae causing primary pyogenicliver abs cess[J]. Infect Dis, 2006, 193(5): 645-654.
[8]Cortés G, Borrell N, de Astorza B, et al. Molecular analysis of the contribution of the capsular polysaccharide and the lipopolysaccharide O side chain to the virulence of Klebsiella pneumoniae in a murine model of pneumonia[J]. Infect Immun, 2002, 70(5): 2583-2590.
[9]Struve C, Bojer M, Krogfelt KA. Identification of a conserved chromosomal region encoding Klebsiella pneumoniae type 1 and type 3 fimbriae and assessment of the role of fimbriae in pathogenicity[J]. Infect Immun, 2009, 77(11): 5016-5024.
[10]Hsieh PF, Lin TL, Lee CZ, et al. Serum-induced iron-acquisition systems and TonB contribute to virulence in Klebsiella pneumoniae causing primary pyogenic liver abscess[J].J Infect Dis, 2008, 197(12): 1717-1727.
[11]Ma LC, Fang CT, Lee CZ, et al. Genomic heterogeneity in Klebsiella pneumoniae strains is associated with primary pyogenic liver abscess and metastatic infection[J].J Infect Dis, 2005, 192(1): 117-128.
[12]Montanari S, Oliver A, Salerno P, et al. Biological cost of hypermutation in Pseudomonas aeruginosa strains from patients with cystic fibrosis[J]. Microbiology, 2007, 153(Pt5):1445-1454.
[13]徐祥，欧琴，李蓓.1株耐亚胺培南肺炎克雷伯菌分型、耐药机制及毒力研究[J]. 临床检验杂志, 2013,31(2):155-157.
[14]Lin JC, Chang FY, Fung CP, et al. Fung High prevalence of phagocytic-resistant capsular serotypes of Klebsiella pneumoniae in liver abscess[J]. Microb Infect, 2004,
6(13):1191-1198.
[15]Fodah RA, Scott JB, Tam HH, et al. Correlation of Klebsiella pneumonia comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model[J]. PLoS
One, 2014, 9(9):e107394.
[16]Chen YJ, Chen SY, Wang JT, et al. Mycotic aneurysm caused by gas-forming serotype K5 Klebsiella pneumoniae[J]. Int J Infect Dis,2009,13(2):e47-e48.
[17]Fang CT, Lai SY, Yi WC, et al. Klebsiella pneumoniae genotype K1: an emerging pathogen that causes septic ocular or central nervous system complications from pyogenic liver abscess[J]. Clin Infect Dis, 2007, 45(3): 284-293.
[18]Pan YJ, Lin TL, Lin YT, et al. Identification of capsular types in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains by wzc sequencing and implications for capsule depolymerase treatment[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015,59(2):1038-1047.。