网织血小板在急性白血病中的检测和临床意义

网织血小板在急性白血病中的检测和临床意义

目的探讨分析急性白血病（AL）患者外周网织血小板（RP）的检测方法以及RP检测的临床意义。方法收集我院血液内科2011年9月~2013年9月住院并接受化疗的AL患者30例，用流式细胞仪（FCM）动态检测AL患者的RP、外周血血小板（PLT）水平，并计算RP百分比（RP%）和RP绝对值（RPC）。并与30例体检健康的受试者作对照。结果治疗前，AL患者的RP%和PRC均低于健康受试者，且具有统计学差异（P＜0.05），经过治疗后，达到临床缓解标准的AL患者RP%和RPC与健康受试者无显著性差异（P>0.05）。结论RP%和RPC不仅可以反映骨髓PLT的生成情况，而且灵敏度比PLT计数高，因此，RP%和RPC可以作为治疗AL过程中的监测指标。

标签：网织血小板；流式细胞仪；急性白血病

网织血小板（Reticulated Platelets，RP）是由骨髓巨核细胞释放进入外周血液的血小板，RP不含细胞核或者DNA成分，但含有少量的信使RNA和粗面内质网用于合成少量的蛋白质，是血液循环系统中最为年轻的血小板[1]。外周血经新亚甲蓝染色后在显微镜下观察到的网状染色无的部分即为RP。RP可以反映外周血小板（Peripheral platelet，PLT）的增生情况、更新速度和骨髓造血系统的细胞动力学变化，是评判PLT生成情况的重要指标[2-3]。急性白血病（Acute Leukemia ，AL）患者PLT较健康者显著减少，其原因复杂。在临床诊治过程中，骨髓功能状态的变化比较大，PLT或者骨髓穿刺是临床上判断白血病患者不同疾病状态的常规诊断方法，然而PLR升高或者骨髓造血功能的恢复存在明显滞后的问题，检验误差大，影响因素多等不足，并且多次骨髓穿刺给患者带来难以忍受的痛苦。而采用流式细胞仪（FCM）、检测PR具有简单、准确、外周血采集量少，无需骨髓穿刺等特点，是一种新型的诊断AL患者疾病状态的方法。应用流式细胞仪检测RP主要是利用网织血小板内残留的少量RNA，可以被多种不溶的核酸特异性荧光染料染色，其中较为好用的是噻唑橙（TO）。噻唑橙能够透过存活的血小板细胞的细胞膜，与核酸结合，标记噻唑橙的血小板观察到的荧光强度显著增强。研究表明RP百分比（RP%）和RP绝对值（RPC）能够反应骨髓中PLT的生成率，并且RP%能够作为预测指标预测外周血中PLT计数的恢复情况。

1资料与方法

1.1一般资料随机选择2011年9月~2013年9月我院收治的30例急性白血病（AL）患者作为治疗组，研究对象经免疫学、骨髓细胞学和骨髓病理学检查证实均符合《血液病诊断和疗效标准》中的诊断标准[4]。其中男性17例，女性13例，患者年龄19~60周岁，中位年龄为32周岁。同时随机选取30例体检健康的受试者作为对照组。其中男性17例，女性13例；患者年龄20~56周岁，中位年龄为34周岁。健康受试者筛选条件：查体肝肾功能正常；心电图正常；五分类全自动血液细胞分析仪血常规检测结果无异常。可排除高脂血症、肾脏疾病，肝脏疾病、心血管疾病、糖尿病。

1.2仪器与试剂噻唑橙（TO）染料（美国Sigma公司）；CD42b单克隆抗体（PE标记）（美国BD公司）；FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3检测方法采集静脉血5μL,加肝素抗凝，加入10μL CD42b单克隆抗体（PE 标记），再加入梯度的TO染料（用生理盐水稀释），并着染不同的时间，确定好实验条件后连续监测标本10次，以检测该方法的可重复性。FACS Calibur型流式细胞仪的设门规则参考[4]等人的方法。分离PLT与红细胞、白细胞及碎片，并用CD41b单克隆抗体来确认PLT的比例。用对照组确定为阳性阈值，然后检测TO染色为阳性的PLT百分比。设定PLT的检测门，检测获得直方图，按照空白对照来设置标尺，使得TO染色呈阳性的PLT为1%，检测20000个PLT，计数TO染色呈阳性的RP，并计算RP百分率，即RP%。RP%和PLT计数结果的乘积得到的数值记为RP绝对值，即RPC。

1.4统计学方法应用SPSS16.0软件对所有数据进行统计分析，计量资料均用”均值±标准差（x±s）”表示。数据比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。

2结果

2.1染色浓度及染色时间的筛选抽取健康受试者加油肝素的静脉血5μL，加入10μL CD42b单克隆抗体（PE标记）后分别再加入500μL梯度稀释的TO（稀释比为1:1、1:2、1:3、1:4），充分混合均匀后静置室温避光。在染色后10、20、30、60、90、120min时，采用流式细胞仪检测RP%。实验结果发现当TO浓度比为1:2，染色时间为30min时，RP%的稳定性最高，是染色的最佳实验条件。

2.2 RP%和PRC的检测结果采用上确定好的实验条件来检测对照组和治疗组的外周血，对照组的RP%核RPC的检测结果为（17.49±9.31）%和（39.23±17.34）；治疗组的检测结果分别为（4.52±

3.10）%和（1.32±0.89）。治疗组的RP%和RPC的检测值均小于对照组，且具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 AL患者治疗后的RP%和RPC检测结果经过治疗后，AL患者中临床缓解的有21例，RP%和RPC的检测结果为（15.23±8.23）%和（35.41±15.56）；未缓解的有9例，检测结果为（8.74±

3.37）%和（10.42±5.16）。未缓解患者的RP%和RPC检测结果显著小于健康受试者和临床缓解患者，且具有显著性差异（P ＜0.05）。而临床缓解患者的检测结果与健康受试者相比，无显著性差异（P＞0.05）。

3讨论

化疗及放疗会导致急性白血病患者出现继发性的骨髓抑制或衰竭，进而引起PLT减少，甚至出血的倾向。化疗后，急性白血病患者PLT能够有效恢复患者外周血的PLT水平，从而预防因为PLT减少而导致的出血。

研究发现，从化疗的第22d开始接受化疗的AL患者外周血的PLT水平可以自行恢复，但RPC的恢复却比PLT提前了2d，研究者认为，因为RPC能够提示诱导或者强化治疗后患者骨髓造血功能的恢复情况，并能够减少患者输注PLT 的次数，所以在化疗期间，对AL患者进行RPC监测较PLT监测也就更有意义[5]。

目前，AL诊疗的依据主要是骨髓穿刺和外周血的检查结果，然而经过化疗后，PLT的动力学变化迅速，目前还没有相关的指标能够预测化疗后PLT的恢复程度。实验研究结果显示，AL患者的RP%及RPC均低于健康受试者，临床缓解的AL患者的RP%及RPC升高，且与健康受试者相比较无统计学差异，而未缓解的AL患者的RP%及RPC水平无明显变化。

参考文献：

[1]Kienast J,Shemitz G.Flow cyctometric analysis of thiazole orange uptake by platelets: a diagnostic acid in the evaluation of thrombocytopenic patients[J].Blood.,1990,75(1):116.

[2]Chao W,Brian RS,Kenneth A,et al.Reticulated platelet predict platelet count recovery following chemotherapy[J].Transfusion,2002,42(3):368.

[3]杨斌,曹祥山,邱国强，等.网织血小板检测在特发性血小板减少性紫癜中的临床意义[J].苏州大学学报(医学版),2006,26(1):120-121.

[4]Takubo T,Yamane T,Hino M,et al.Clinical significance of stimultaneous measurement of reticulated platelets and large platelets in idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Haematologia(Budap)，2000,30(3):183-192.

[5]Stohlawetz P,Stiegler G, Knobl P,et al.The rise of reticulated platelets after intensive chemotherapy for AML reduces the need for platelet transfusions[J].Ann Hematol.1999,78(2):271-273.