植物超氧阴离子自由基含量的测定

植物超氧阴离子自由基含量的测定

一、实验目的

学习测定植物组织中超氧阴离子自由基含量的方法

二、实验原理

进入生物体内的一些分子氧（O2），可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基，特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。超氧阴离子即可直接作用于蛋白质和核酸等生物分子，也可衍生为羟自由基、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化物自由基等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏。因此测定逆境条件下植物组织中超氧阴离子自由基产生及清除速率，可间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱。超氧阴离子自由基（O2−·）能与羟胺反应，生成N O2−，N O2−能与对氨基苯磺酸和а-萘胺反应生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm波长处具有显著光吸收。因此利用羟胺氧化的方法可以测定植物组织中超氧阴离子自由基（O2−·）的含量。

三、器材与试剂

1．实验仪器与用具

研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（10mL）、分光光度计

2．实验试剂

65mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8）；提取缓冲液；10mmol/L盐酸羟胺溶液；

标58mmol/L对氨基苯磺酸溶液；7mmol/L а-萘胺溶液；50μmol/LKNO

2准溶液

3．实验材料

小白菜、小麦

四、实验步骤

1.制作标准曲线

取7支试管，编号，按表1分别加入各种试剂，摇匀。置25℃保温箱20min。

分别加入1mL 58mmol/L 对氨基苯磺酸溶液和1mL 7mmol/Lа-萘胺溶液，混匀。25℃保温20min，以0号管为对照进行调零，立即在波长530nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，N O2−物质的量（5μmol）为横坐标，制作标

准曲线。

表1 标准曲线试剂表

2.提取

取逆境处理的小白菜或者小麦叶片，正常条件下生活的叶片作为对照，剪碎混匀，分别称取1g样品，加入3ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，于8000r、4℃离心10min，收集上清液，此液为植物O2−提取液。

3.测定

取2.0ml上清液，加入0.5ml 50mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8）和0.1ml 10mmol/L盐酸羟胺溶液，摇匀，25℃保温20min。取出加入1ml 58mmol/L对氨基苯磺酸溶液和1ml 7mmol/L а-萘胺溶液，混匀，30℃保温30min，加入等体积三氯甲烷萃取色素，10000r/min离心3min，取上层粉红色水相，测定530nm吸光度。

表2 N O2−产生

表3 N O2−产生显色（同标准曲线）

五、实验数据处理及分析

根据样品管显色液与对照管显色液吸光值的差值，从标准曲线上查出相应的N O2−的浓度，并换算成超氧阴离子（O2−·）物质的量的浓度，从而计算出O2−的含量。

O2−含量(μg/g)=2x·V t·n/（F w·V s）

式中，n为羟胺氧化反应产生的N O2−（μmol）；V

t

为酶提取液总体积（mL）；

V s 为羟胺氧化反应加入的粗酶提取液体积（mL）；F

w

为样品鲜重（g）。

试管 1 2 3 4 5 6 7 吸光

度

0 0.096 0.213 0.445 0.618 0.805 0.970

样品

白菜（空

白）

白菜麦子（空白）麦子鲜重 1.178g 1.016g

吸光度0.187 0.523 0.089 0.199

由回归方程y=0.4906x+0.0151可得白菜中N O2−的浓度（5μg/ml）为0.654，小麦中N O2−的浓度（5μg/ml）为0.193。

白菜中O2−的含量（μg/g）=2x·V

t ·n/（F

w

·V

s

）

=2×10×0.654/(1.178×2×5) =1.111

白菜中O2−的含量（μg/g）=2x·V

t ·n/（F

w

·V

s

）

=2×10×0.193/(1.016×2×5)

=0.380780725

六、讨论

为什么O-

2

主要分布在小白菜的维管束中？

通过观察可以发现，O-

2

主要分布在小白菜的叶柄和叶脉,即维管束中。植物

在代谢过程中会产生许多活性氧自由基，线粒体是需氧生物细胞内产生O-

2

最多的地方。在整个电子传递链上传递大量电子时，已经有实验证实有些电子被漏出来，使氧气发生了电子还原而产生超氧阴离子自由基。

维管束是指维管植物的维管组织，由木质部和韧皮部成束状排列形成的结构。维管束彼此交织连接，构成初生植物体输导水分，无机盐及有机物质的一

种输导系统。O-

2产生的途径有很多，适宜浓度的O-

2

在体内有重要意义，参与吞

噬细胞杀灭有害的微生物，协助清除衰老、褪变的细胞，消灭突变的细胞等。所以作为主要运输途径的维管束，O-

2

在其中的含量必然会很高。

七、实验注意事项

1、分光光度计应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。要先预热10min，用0试管中的样品进行调零，比色杯的外壁要擦干净。

2、取待测样品研磨定容时，可对其质量及容积等体积放大，最好用纱布过滤，这样能保证上清液的澄清度。

3、离心机在预冷状态时，离心机盖必须关闭。使用时注意先配平。

4、介质尽量减少Fe和O2的存在，α-萘胺不能用β-萘胺代替。

5、显色反应后也可用等体积的正丁醇萃取（混匀、静置分层或离心）红色偶氮物质，然后测定正丁醇相的A530.

6、用移液管移试剂时应该选用不同刻度的移液管，避免产生误差。