土壤中放线菌的分离与纯化

土壤中放线菌得分离与纯化

实验目得

１掌握放线菌得生长特性,微生物得培养方法。

2掌握微生物实验得基本生物技术,主要包括无菌操作技术，纯种分离技术,纯种培养技术,以及抗生素检测等.

3掌握合成培养基,选择培养基得制备方法.

４学习对微生物实验得中出现问题得分析,解决方法

实验材料

药品:可溶性淀粉、KNO3、NaＣl、K2HＰＯ4•3Ｈ2O、MｇＳO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂、重铬酸钾

其她:高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。

实验原理

放线菌就是重要得抗生素产生菌,主要分布在土壤中(主要就是链霉菌),其数量仅次于细菌.一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好得土壤中含量较多．由于土壤中得微生物就是各种不同种类微生物得混合体,为了研究某种微生物,就必须把它们从这些混杂得微生物群体中分离出来,从而获得某一菌株得纯培养。分离放线菌常用稀释

倒平板法．根据放线菌得营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变,或土壤预先处理（12０℃热处理1ｈ),或加入某种抑制剂（如加数滴１０%酚等),都可以使细菌,霉菌出现得数量大大减少,从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株．放线菌可以产生抗生素，抑制其她菌种得生长,故可用金黄色葡萄球菌(Ｇ+)与大肠杆菌(G-)作指示菌鉴别放线菌。

高氏一号合成培养基就是培养放线菌得培养基。这种培养基就是采用化学成分完全了解得纯试剂配制而成得培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNＯ3 、NaCl 、Ｋ2ＨPO4•３H2O 、MgS Ｏ4•7Ｈ２Ｏ作为无机盐，FeＳＯ4•７H２O作为微生物得微量元素,提供铁离子等组成

１、高氏一号合成培养基得制备

K2HPO４•3H２O 0。125ｇ，可溶性淀粉５g，硝酸钾0、25， M ｇSＯ4•7H2O0.125g, FeSO4•7H2O 0。０25g,氯化钠0.１2５ｇ，琼脂５g,水25０mｌ.

配制时,先依次加入上述药品(除琼脂外)顺序溶解,加入无菌水至250ml,调节pH=７、4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后, 12１℃灭菌２０分钟。

将6套平皿、１2只试管灭菌.

2、土壤中放线菌得分离

1。编号,分装：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签,注明土壤稀释液得稀释度（1０—3、1０—4、10－5)。每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至5０℃左右得高氏一号培养基15~20ｍl左右,待冷凝成平板。

另取５支盛有9ml一只盛有１０ｍl无菌水得试管,排列于试管架上，依次标明1０-1、10—2、１0—3、10—4、10-5、10－6.

２.稀释倾注分离

称１g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min，即10—1得土壤悬液，静置30s。

用无菌吸管无菌操作取1０—１浓度得土壤悬液1ｍｌ并加入编号１0—2得无菌试管中,并吹吸吸管2~３次，吸时伸入管底,吹时离开水面，使其混合均匀。即为１0－2浓度得土壤稀释液。依此类推,直到稀释至10—5得试管中(每个稀释度换1支无菌吸管).

如图

3．倒平板分离培养

于上述盛有不同稀释度菌液得培养皿中,倒入溶化后冷却至４5℃左右得高氏培养基约１0—15ml，置水平位置,迅速旋动混匀，待凝固。（若融化得培养基温度太高,会产生太多得冷凝水，影响观察．）用1mｌ无菌吸管分别精确地吸取10—４、１0—５、10—６得稀释菌液１ｍｌ,对号放入编好号得无菌培养皿中,每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始)将加入平板培养基上得土壤稀释液在整个平板表面涂匀,涂完一个平板用酒精灯灭菌。

稀释涂布平板法

４培养接种完毕,将平皿与试管放入28℃恒温箱培养７天,观察平皿上放线菌（主要就是链霉菌)菌落。

菌种纯化

1、倒平板将加热融化得高氏一号合成培养基倒平板,并标号．

２、平板划线

划线得方法很多,但无论哪种方法划线,其目得都就是通过划线将

样品在平板上进行稀释,使形成单个菌落。常用得划线方法有下列二种：

图Ⅴ—3 划线分离示意图

⑴分区划线用接将培养皿底部用姆指与无名指固定成倾斜状态,在火焰旁将培养皿稍微打开.在此同时,用环状接种针在火焰旁刮取少许菌苔，在平板培养基得一边，作第１次平行划线６～7条,转动培养皿约７0°角,用烧过冷却得接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线（图Ⅴ－3),然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时,接种针应与平板表面成３0°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘,也不要将培养基划破。划线完毕后,盖上皿盖,倒置于温室培养。

⑵连续划线将挑取有样品得接种环在平板培养基上作连续划

线(图Ⅴ—4,B)。划线完毕后,盖上皿盖，倒置28℃培

养.

V—4划线分离示意图

拮抗实验

长出菌落后,要判断就是否已分离到了纯菌种.

１配置鉴别培养基配置金黄色葡萄球菌与大肠杆菌培养基。

2标号在两平板上标注均匀间隔得7个区域。

2挑菌落在纯培养得平板上切取生长较好得放线菌落依次放入标注区域中(在火焰旁切取）,置于２8℃恒温箱培养1天后可观察到有抑菌圈生成。

讨论

1 高氏培养基得配置关键就是pＨ值得调节与重铬酸钾得加入.放线菌得最适生长条件就是23～３７,pH7、0～７、5，而在同样条件下也利于霉菌生长。在高温杀菌下,放线菌与霉菌得孢子仍可以存活,所以必须加入重铬酸钾抑制霉菌与细菌得生长（对放线菌无抑制作用）。否则霉菌大量生长.如图

培养基配置时各成分得溶解顺序应就是先加缓冲化合物，后就是主要元素、次要元素.调节pＨ值时,加入酸碱要缓慢、少量、多加搅拌,防止局部过酸或过碱而破坏营养成分.

我们第一次配置得高氏培养基很可能就就是由于酸碱调节时酸碱