环境微生物多样性研究方法进展_窦敏娜

科学分类号: X171 文献标识码: B
文章编号: ( G ) 10045( 2010) 01- 60- 04
环境微生物是由多个种群 ( popu lation) 组成的 微生物群落 ( comm unity) , 不同 种群之间 存在着共 生、互利、共存、竞争等各种复杂的关系, 在物质循环 和能量转化过程中发挥着重要作用。对环境微生物 群落的研究可以从微生物的量、代谢活性、群落结构 多样性及代谢功能等几个不同层面上进行。其中, 微生物群落多样性是环境微生物群落研究的核心内 容。研究环境微生物多样性可以了解微生物群落结 构, 微生物的种类和数量分布特点, 并且可以从群落 水平上了解和评价生物修复和生物处理技术的机理 与效果, 同时为控制和优化微生物群落结构提供参 考 [ 1] 。环境微生 物多样性的研究已 经应用于生命 起源的探索, 环境的保护治理, 新型抗生素的筛选等 多种领域 [ 2] 。
由于微生物培养方法存在许多不足, 只能反映 极少数微生物的信息, 所测结果误差较大, 埋没了大 量极有应用价值的微生物资源。因此这种传统的研 究方法只能作为一种辅助手段, 并且只有结合现代 生物技术来才能较为客观而全面的反映微生物群落 结构的真实信息。但这种方法在分离具有一定功能 的特殊目标物种时是非常有用的, 利用这种方法已 获得许多很有应用价值的微生物种类, 并应用于基 因介导及生态修复等方面。
3 磷脂脂肪酸方法
磷脂脂肪酸谱 ( PLFA pro file) 常被用于研究复 杂群落中微生物的多样性。磷脂是所有生活细胞的 细胞膜的基本组分。 PLFA 是磷脂的组分。具有结 构多样性和高的生物学特异性, 是特有效的生物标 记物, 可用于了解微生物群落结构。总 PLFA 谱中
某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌是特异 的, 且在大多数情况下 PLFA 的某专一类型在某一 土壤微生物分类群中占优势。至今, 已经积累了大 量关于微生物脂类的脂肪酸组成的数据。 PLFA 或 酯链 PLFA ( EL ) PLFA ) 的总 量已被用作土 壤样品 中微生物生物量的指示物 ( indica tor) [ 9] 。
多样性研究中, 如果可能的话, 需要将各 种方法结合起来使用, 从而获取关 于环境微 生物群落多 样性的更 多和更完
整的信息和理解。相信传统的分析方法 和现代分子生物学技术方法等多种方法相结合将是大力推动环境微生物多
样性研究的有效方式。
关键词: 环境微生物; 群落多样性; 微生物标记物法; BIOLOG GN 系统; 分子生物学技术
2010年 3 月 综述 ( 60~ 63)
环境研 究与监测
环境微生物多样性研究方法进展
第 23 卷
窦敏娜
(咸阳职业技术学院, 陕 西 咸阳 712000)
摘要: 本文对当前国内外环境微生 物多 样性研 究的 四种方 法: 传统 微生 物平板 培养 法、微生物 标记 物法 (如 PLFA
法 ) 、B IOLOG 微平板法和微生物分子生物技术方法及其应用特点进行了简要的评述 和分析。并指出在 环境微生物
AFLP 技术 的优点是 效率高、稳定性 好。但同 时也 存在 着 一 些缺 点, 如: AFLP 技 术 费用 昂 贵; AFLP 分析需要同位索或 非同位索标记引 物, 必须
PLFA方法是一种快速、可靠而 可重现的 分析 环境微生物群落结构的方法, 可用于表征在数量上 占优势的环境微生物 群落, 包 括不可培养微生 物。 该方法最适合用作总微生物群落分析, 而不是专一 的微生物种类的研究。 PLFA 的组成和浓度受环境 微生物 生长 条件和 生理 状态 的影 响。另 外, 包 括 PLFA 在 内的 所有 的环 境 生 物 标 记 都 存在 可 萃 取 性 ( extractab ility) 和未知的稳定性问题。土壤的生物 标记稳定性主要取决于与降解过程有直接关系的温 度、湿度和其他条件 [ 11, 12] 。
对微生物学者来说, 仅区分细菌和真菌是不够 的。因为这样忽视了许多微 生物种类和功 能性亚 种。应用磷脂类化合物的脂肪酸组成来研究微生物 群落结构多样性是近几年来发展的一种新方法。磷 脂类化合物只存在于所有生物细胞膜中, 一旦生物 细胞死亡, 其中的磷脂类化合物马上消失, 生物中的 磷脂类化合物能显示出快速转换率, 而且生物可以 把相对稳定的磷脂类化合物作为它们的生物量, 磷 脂类化合物的这些特性和磷脂类化合物与生物的密 切关系, 可用 作土壤中微生物 群落结构指纹分 析。 为土壤微生物群落结构的研究提供了一个较简便、 准确的方法。 PLFA方法适合跟踪研究微生物群落 的动态变化, 能够快速有效的从环境样品种提取大 部分脂肪酸, 但是也有其局限性。第一, 它不能从种 的水平上鉴定微生物, 只能鉴定到属; 第二, 这种方 法强烈的依赖于标记脂肪酸, 标记脂肪酸变化导致 错误的群落变 化估计。因此 操作过程需要 十分谨 慎, 防止人为因素的干扰; 第三, 细菌和真菌在不同 的生长时期以及环境压力 下的脂肪酸含量 有所变 化, 给监测带来困难 [ 10] 。
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环境研究与监测
第 23卷 第 1期
技术即聚合酶链式反应, 是一种体外扩增核酸序列 从而得到多个核酸拷贝的技术, 可用于土壤微生物 DNA 扩增, 并 对扩 增 产物 进 行定 量 或定 性分 析; DGGE 即变性梯度凝胶电泳, 是根据 PCR 扩增产物 中长度系统但不同 G+ C 含量的 rDNA 片段混合物 在电泳胶中的移动位置不一样, 进而形成不同 rDNA 指纹剖面, 故可直接反映土壤微生物 rDNA 的多态 性。 RFLP 是利用 PCR 扩增产物用限制性内切酶进 行切割并电泳, 以酶切后 DNA 片段长度变化来表现 出来, 通过 DNA 转印及分子杂交方法检测。 411 RFLP 技术
微生物平板纯培养法是用于估计微生物多样性 的传统方法, 被认为是监测特殊微生物群变化的非
收校日期: 2009 - 12- 29 作者简介: 窦敏娜 ( 1982- ) , 微生物学硕士研究生, 助讲, 主要 从事
环境微生物研究工作。
常有效的 方法 [ 3] 。根据目标 微生物选择相 应的培 养基, 然后通过各种微生物的生理生化特征及外观 形态等方面进行分析鉴定。可用于跟踪特定分类组 ( g roup)或功能组的微生物数量, 并评价在该平板上 的微生物群落的组成。但后者需从琼脂平板上将菌 落分离出来, 并对分离菌进行鉴定。由所得到的分 类组或分类群的分布情况可了解群落的结构。这种 方法对于衡量小群体多样性方面不失为一种快速的 方法 [ 4] 。由于这种方法人为限定了一些培养条件, 无法全面反映微生物生长的自然条件, 常常造成某 些微生物的富集生长, 而另一些微生物缺失。只有 一小部分环境微生物群落可用这种方法得到, 根据 hm flnn 等的评估, 大约 80% ~ 99% 的微生物种不可 培养或未能得到培养, 说明大部分微生物的特征不 能用传统的琼脂培养基平板培养技术来描述 [ 5] 。
环境微生物多样性的研究方法很多, 从国内外 目前采用的方法来看, 大致上包括以下四类: ( 1) 传 统的微生物平板纯培养方法; ( 2) B iolog 微平板分析 方法; ( 3) 磷脂脂肪酸法 ( PLFA ); ( 4) 分子生物学技 术方法等。本文就对这几种主要方法作以简单介绍 和评述。
1 微生物平板纯培养法
目前应用 B IOLOG系统研究环境微生物群落的 结构和功能还存在一定的局限性, 因为它所得出的 结构和功能方面的信息是基于在 B IOLOG GN 系统 内生长的微生物, 主要是革兰氏阴性菌。该方法对 快速生长和适合在实验条件下生长的小部分群落成 员有强烈的选择性且被测试的底物不能准确地代表 出现于生态系统中的底物类型。 B io log反应特征只 能粗略地代表实际土壤环境微生物群体底物利用的 动力学特 征 [ 5] 。另 外由 于培 养环境 如湿 度、渗透 压、pH 值等方面的改变都可能引起微生物对碳底物 实际利用能力的改变而造成一定的误差。目前所拥 有的标准数据库还不完善, 有些种类还不能被准确 鉴定。尽管有这些不足之处, 但该方法仍是一种较 为快速、简便的好方法, 可以获得大量土壤环境微生 物群落结构和功能多样性方面的信息 [ 8] 。
但也不能忽视这种传统微生 物培养方法的作 用, 因为许多微生物资源的开发与利用还是要依赖 传统的平板培养技术。所以针对难培养微生物和不 可培养微生物, 当前, 部分学者致力于提高微生物在
第 1期
窦敏娜: 环百度文库微生物多样性研究方法进展
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平板上的培养能力。 Kaebede in 认为实验室培养条 件与微生物生活的自然环境相差过远, 特别是培养 基成分的前后变化是影响微生物实验室培养的一个 关键因素。它以海洋微生物为样品, 设计了原位培 养技术。在该实验中采用潮间带海洋沉积物作为微 生物生长所用的培养基, 通过独特的扩散小室培养, 获得数种在普通琼脂平板上无法获得的菌种 [ 6 ] 。
AFLP 是通过限制性内切酶片段的不同长度检 测 DNA 多态性的一种 DNA 分子标记技术, 其原理 是利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大 小的 DNA 片段再进行选择性扩增, 使用双链人工接 头与基因组 DNA 的酶切片段相连接作为扩增反应 的模板 DNA, 用含有选择性碱基的引物对模板 DNA 基因选择性扩增, 获得的 DNA 扩增片段通过变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳分离检测, 根据扩增片段长度的 不同检出多态性。AFLP 的特点主要表现在: ¹ 由 于采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目有 很多, 理论上, AFLP 标记数目是无限的。还可以调 整选择性碱基数目, 可以准确调节扩增带的数目; º AFLP 在检测 DNA 的多态性是非常高效的, 典型的 AFLP 分析, 每次反应 的产物经过聚 丙烯酰胺凝胶 电泳检测到的谱带在 50~ 100条之间 [ 16 ] 。
4 分子生物学技术
最近 20~ 30年间, 以核酸分析技术为主的分子 生物学技术 ( 如 PCR 、RFLP、RAPD、PCR - DGGE / TGG E、AFLP、A LH P 等 ) [ 7, 13, 16] 的广泛应用, 为从分 子水平揭示生物多样性提供了新的方法论, 开拓了 分子生物学与生态学的交叉领域, 分子生物学技术 也逐渐被应 用到微生 物多样性 的研究中 来。 PCR
RFLP 是 Boste in( 1980)首先提出的一种分子遗 传标记。 RFLP 反映 了 DNA 水 平 上的 变 异, 任何 DNA 序列的改变 ( 如插入、重排、缺失等 ) 都会改变 原有酶切位点所在位置, 从而使两酶切点间的 DNA 片段长度发生变化, 这种变化经酶切、杂交放射自显 影就会使 RFLP 带的特征有所改变, 由此即可对生 物的变异进行分析。目前该方法已越来越广泛用于 土壤微生物多样性的研究。 PCR) RFLP 法是 PCR 引物中的一条加以荧光标记, 反应后用合适的限制 酶切、电泳分析, 再根据片断的大小不同以及标记片 断种类和数量的不同分析群落的结 构及组成多样 性。现在很多研究 人员利用 16srRNA 来研究土壤 微生物的多样性 。该技术还可以用来监测因环境 改变而引起的微生物种群的变化。 412 AFLP 技术
2 B io log微平板分析法
B io log法是美 国 BIOLOG 公司于 1989 年开发 成功的一种新型微生 物鉴定方法 [ 1] 。该方法依据 微生物在利用碳源过程中产生的自由电子与四唑盐 染料可发生还原显色反应的原理, 颜色的深浅表示 微生物对碳源的利用程度。通过在一块微平板上同 时测定微生物对不同单一碳源的利用能力 ( SCSU ) , 来鉴定纯种微生物或比较分析不同的微生物群落。 B io log法可用于多种病原微生物鉴定和环境微生物 群落的研究。通过 B io log法进行环境微生物研究无 需分离培养纯种微生物, 即可获得有关微生物群落 总体活性与代谢功能的信息, 最大限度地保留微生 物群落原来的代谢特征, 且灵敏度高, 分辨力强, 数 据的读取与记录可以由计算机辅助完成。