改良阿霉素肾病大鼠模型的建立

Establishment of a modified model of adriamycin nephrosis in rats
YA NG Wei-na1 , YU Li n-hua 2 , G UO Shang-w en2 , CH ENG Shao-li3 , CHA I Yun3 ( 1. Depart ment o f H um an Anat omy , Hi st ology & Embryo logy , M edical School of Xi an Jiaot ong Uni versit y ; 2. Depart ment of P atholog y , Medical Schoo l o f Xi an Jiao to ng Universi ty ; 3. Center of Mo rpholo gy , M edical School of Xi an Jiaot ong Uni versit y , Xi an 710061 , Chi na)
To study the adriamycin nephrosis mode l in diffe rent development pathological stages . ABSTRACT : Object ive -vein twice e ver y Methods The r at adr iam ycin nephr osis model was established by injecting adriamycin into tail two wee ks to de tect blood and ur ina biochem ical indic ator s and to obser ve the pathological ch anges of the re nal tissues .Results The model showe d se rious edema , proteinur ia , hypoproteine mia , and hyper lipidemia . P odocytes wer e swolle n and mesangial cells de veloped mild hyper plasia at the end of the four th week .The nephric tubule atr ophie d a t the e nd of the eighth week accompanied with adhesion between glomer uli and Bowman s c apsule . Glomer uli scler osis of m ild or m edium degre e was obser ved at the end of the twelf th wee k with obvious lymphoc yte inf iltra tion in the re nal inte rstitium as we ll as the f orma tion of collage n f ibers .Conclusion The adriamycin ne phr osis m odel was successf ully deve loped by injecting adr ia mycin 4 m g/ kg into t ail-vein twice e ver y two wee ks . The acute model is similar to human minimal change dise ase , and the chronic model is sim ilar to hum an f oc al segme ntal glomer uloscler osis . adr iam ycin nephr opa thy ; podocyte ; m inim al cha nge dise ase ;focal segme ntal glomer uloscler osis KEY WORDS :
阿霉 素肾病 ( adriamyci n nephro pat hy )动 物模 型是继嘌呤霉素肾病动物模型后的另一种在肾脏病 研究 领 域 中 广 泛 应 用 的 动 物 模 型 。 阿 霉 素 ( adriamy cin , ADR)诱导的肾病模 型可分为急性模 型和慢性模型 。 急性模型病理学改变类似人的微小病 变性肾病( minim al chang e disease , M CD) , 慢性模型 病理学改变类似人的局灶 节段性肾小球硬 化( f ocal
收稿日期 : 2008-07 -16 修回日期 : 2008 - 10 -25 通讯作者 : 于琳华 , 教授 . E -m ail : lhy u89 @mai l . xjt u . edu . cn 作者简介 : 杨维娜 ( 1975 ) , 女( 汉 族) , 在 读博士 , 讲师 . 研究 方向 : 肾 脏病理 . E - mail : w n yang @mai l . xjt u . edu . cn
第 30 卷第 4 期 2 0 0 9年 8月
wk.baidu.com
西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) Jour nal of Xi an Jiaotong University( Medical Scie nces)
Vol . 30 No . 4 Aug . 2009
改良阿霉素肾病大鼠模型的建立
杨维娜 , 于琳华 , 郭尚温 , 成少利 , 柴 云
segmental glo merulosclerosis , F SGS ) 。我们 在实 际 应用过程中发现 , 文献报道的造模方法或多或少存在 一些缺陷 。 因此 , 我们在以往研究的基础上 , 对阿霉素 肾病模型进行了改良 。 以期为研究不同病理发展阶段 的肾小球疾病提供一种更好的动物模型 。 1 材料与方法 1. 1 动物与试剂 健康清洁级雄性 SD 大鼠 60 只 , 重 180 ～ 220 g 左右 , 由西安交通大学医学院实验动 物中心提供 。 注射前大鼠经适应性标准饲养 3 d , 尿蛋 白均为阴 性 。将 大鼠 随 机分 为阿 霉素 肾 病模 型 组
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系膜基质面积 / 肾小球毛细血管襻面积比( 肾小球系 膜基质相对面 积)的 平均值 , 为基质增 多的相对 含 量; 并测量每个肾小球中 5 个开放最大的毛细血管直 径以观察毛细血管开放程度 。 人工观察并计算肾小 球硬化指数 : 将切片中每个肾小球硬化程度分为 0 ～ 4级。 0 级: 肾小球基本正常 ; 1 级: 肾小球硬化面积 ≤ 25 %; 2 级: 25 % < 肾 小球硬化 面积 ≤ 50 %; 3 级: 50 % <肾小球硬化面积 ≤75 %; 4级: 75 % <肾小球 硬化面积 ≤ 100 %, 肾小球硬化指数( GI)=[ ( 1N1 + 2N2 +3N3 +4N4) / 每切片的肾小球总数] ×100 %, 式中 N1 、 N2 、N3 、 N4 分别代表 1 级 、2 级 、3 级 、 4 级损 害的肾小球个数[ 2] 。 主要观察指标有肾小球硬化指数 、 肾小球毛细血 管丛管腔开放程度( μ m) 、 P AS 阳性区面积( μ m ) 、毛 2 细血管襻横截面积( μ m )和肾小球系膜基质相对面 积( % ) 。 1. 6 统计学处理 应用 SP SS12 . 0 统计分析软件对 实验数据进行统计学处理 , 所有数值以均数 ± 标准 差表示 , 两组间的比较应用方 差齐性检验后 , 采用 t 或 t′ 检验 , 多组间的比较应用单因素方差分析后 , 采 用 LSD 检验做各组间均数的两两比较 。 P <0 . 05 表 示有统计学意义 。 2 结 果 2. 1 一般情况 模型组 40 只大鼠于阿霉素注射后 第 5 天均出现不同程度的腹泻 , 食量下降且 活动减 少 , 至第 10 天腹泻停止 , 活动逐渐恢复 。 第 3 周出现 轻度水肿 , 以足 、腹 、 睾丸较明显 。 第 4 、5 周水肿加重 , 第 6 周部分鼠出现不同程度的腹水现象 。 期间 3 只大 鼠死亡 , 1 只 制备 模型失 败被 剔 除 。模型 成 功率 达 90 %。 对照组大鼠健康存活 。 2. 2 各组大鼠尿蛋白的定量分析 阿霉素组第 2 次 注射 ADR 1 周末 、 4 周末 、 8 周末 、 12 周末 24 h 尿蛋白定 量与同期正常对照组相比有显著性差异( P <0 . 01) , 且随时间延长 24 h 尿蛋白定量逐渐增高 , 12 周末达高 峰( 表 1) 。 2. 3 各组大鼠血生化指标的检测 对照组无明显异 常; 第 2 次注射阿霉素 4 周末 , 阿霉素组血清总蛋白 、 白 蛋白开始下降( P <0 . 05) , 8 周末明显下降 , 12 周末达最 低值 ; 甘油三酯 、 总胆固醇 4 周末开始升高( P <0 . 05) , 8 周 末达高峰 , 12 周末略有下降 ; 血尿素氮 、 血肌酐 4 周末变化不明显 , 8 周末开始升高( P <0. 05) , 12 周 末明显升高 , 表明已有肾功能的损伤( 表 2) 。
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( 西安交通大学医学院 : 1 .人体解剖学与组织胚胎学系 ; 2. 病理学系 ; 3 .形态中心 , 陕 西西安 710061) 摘要 : 目的 探讨阿霉素肾病在不同病理发展阶段动物模型的制作 。 方法 采用间隔 2 周两次尾静脉注射阿霉素的 方法复制大鼠阿霉素肾病模型 , 观察各组大鼠血 、尿生化指 标和肾 组织病 理学的 改变 。 结果 该模型 表现为 严重水 肿 、大量蛋白尿 、低蛋白血症和高脂 血症 ; 病 理学检查显示 , 4 周末肾小球足细胞 肿胀 , 系 膜细胞轻度增生 ; 8 周末有球 囊粘连 , 肾小管上皮细胞萎缩 ; 12 周末部分肾小球节段性轻 、中度硬化 , 间质内有明显灶性淋 巴细胞浸 润 , 并 有轻度纤 维化 。 结论 经改良间隔 2 周两次尾静脉内注射阿霉素 4 mg/ kg , 可以成功复制阿霉素肾病模型 。 急性模型 病理学改 变类似人的微小病变性肾病 , 慢性模型病理学改 变类似人的局灶节段性肾小球硬化 。 关键词 : 阿霉素肾病 ; 足细胞 ; 微小病变性肾病 ; 局灶节段性肾小球硬化 中图分类号 : R365 . 69 ; R181 . 2 文献标志 码 : A 文章编号 : 1671-8259( 2009) 04 -0445-04
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( 40 只) 和正常对 照组 ( 20 只) 。 注 射用盐 酸阿 霉素 10 支 , 10 mg / 支 , 由浙江海正药业股份有限 公司生 产。 批准文号 : 国药准字 H 33021980 。 1. 2 模型的制作 阿霉素肾病模型组于实验开始后 第4 天 、 第 18 天分别从尾静脉注射 ADR 4 mg/ kg ( 阿霉 素按 2 g / L 溶于生理盐水中 , 即 2 m L/ kg ) ; 对照组于 实验开始后第 4 天 、第 18 天分别从尾静脉注射等容 积生理盐水 , 放入代谢笼内饲养 , 自由摄食 、饮水 。 从 第 2 次注射后连续观察至 12 周末 。 存活的大鼠第 2 次 注射 ADR 后 7 、 14 d 时 检 测 尿蛋 白 , 尿 蛋白 定 量 > 100 mg / 24 h 提示模型复制成功 , 计入实验 。 1. 3 大鼠的血 、 尿的生化检测 各组均于第 1 次阿 霉素注射前 1 d 、 第 2 次阿霉素注射后 1 周末 、 4 周末 、 8 周末及 12 周末用代谢笼收集 24 h 尿液 , 用量杯测尿 量 , 摇匀取 3 m L , 3 000 r/ min , 离心 5 mi n , 去除沉渣 , -20 ℃ 冰箱保存待测 。 阿霉素组于收集尿液结束当 天随机各取大鼠 10 只 、对照组相应每次随机取大鼠 5 只 , 乙醚吸入麻醉 , 心脏穿刺采血 , 室温下 2 h 内离 心 , 3 000 r/ min , 离心 5 min , 取血清 , -20 ℃ 冰箱保 存待测 。用 柳 氮 磺酸 比 浊 法检 测 尿 蛋白 。用 日 立 7600A 全自动生化仪检测血清总蛋白( t ot al pro tein , T P) 、白蛋白 ( albumin , A LB) 、胆固醇 ( cholesterol , Cho L) 、 甘油 三酯 ( t rig lyceride , T G) 、 血 尿素 氮 ( blood urea ni trog en , BUN)及血肌酐 。 1. 4 病理形态学的观察 分别于 1 周末 、 4 周末 、 8 周末及 12 周末收集尿液 及心脏穿刺采血后 处死大 鼠 , 剖腹取肾 , 分为二部分 , 分别用 FAA 和 25 m L/ L 戊二醛固定 。 进行如下观察 : ① 光镜观察 。 肾组织经 FAA 固定 、 乙醇脱水 、 石蜡包埋后 , 制成 3 μ m 厚的石 蜡切片 , 做普通 H E 、 P AS 染色及 M asson 特殊染色 , O ly mpus 光学显 微镜下观察肾 组织形态学的 改变 。 ② 透 射电镜观察 。 肾组织取出后切成 1 mm 的小块 , 经 25 m L/ L 的戊二醛 固定 、1 g/ L 磷 酸盐缓冲 液浸 洗、 10 g/ L 四氧化俄固定 、1 g/ L 磷酸盐缓冲液浸洗 、 乙醇梯度脱水 、环氧树脂 EPON812 浸透 、 包埋 , 聚合 后作半超薄切片 1 ～ 2 u , 美蓝染色后光学显微镜下 定位 , 超薄切片机进行超薄切片 50 ～ 70 nm , 醋酸铀 、 柠檬酸铅染色后透射式电子显微镜下观察 、 拍照 。 1. 5 肾小球病理变化的半定量分析 采用 MO T IC 病理图像分析系统对肾小球病理变化进行半定量分 析。 应用 PAS 染色标本 , 每组选 6 个样本 , 每例样本均 在 40 倍显微镜下随机选取 10 个肾小球输入计算机 , 采集系膜基质着色区 , 画定肾小球毛细血管襻区域 , 进行肾小球的病理图像分析 , 分别得出 10 个肾小球