培养基母液的制备

• 2、操作前的准备工作
• 接种室在接种前4-5 d必须通风换气。在接种前一 天对接种室进行全面消毒，一般用40%福尔马林 进行全面喷雾，并密闭24 h，然后打开换气窗1015 min.。
• 接种前1 h打开超净工作台和棚面的紫外灯照射30 min。
• 杀菌结束后，先关掉棚面的紫外灯，再打开风机， 最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后体息 时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打 开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同 时关闭或先关闭风机再开紫外灯。不可穿工作服 离开接种室，接种期间两边的门切记要关闭。
实验室安全守则
• 一般规定
• 1、上课第一天请先熟悉环境，察看紧急冲 洗站、洗眼站、灭火器、急救箱及安全梯 等的位置，牢记“安全”是进行任何实验 最重要的准则。
• 2、在实验室內请穿着实验服，避免穿凉鞋、 拖鞋。留有长发者，戴帽套将头发捲入套 內，或以橡皮筋束于后，以防止引火危险 或污染实验。
• 3、在实验室内禁止吸烟、饮食、化妆、嚼口香糖、 嬉戏奔跑，食物饮料勿存放于实验室的冰箱中， 实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服及杂物等。
• 无菌操作室应备有超净工作台或接种箱、固定式 载物台、移动式载物台、广口瓶、酒精灯、纱布、 器械支架、手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等。
• 1.5培养室
• 应尽量安排在楼层较高处，以利于采光，减少尘 埃和杂菌污染的机会。此外应考虑清洁、干燥， 培养室保温隔热。培养室中距离窗户较远处的培 养架应适当安装人工辅助照明的日光灯。应设计 能有效通风的窗户、定期或需要时加强通风散热， 如在室内地板稍高处设置进风气窗，在气窗的对 侧近天花板设置排风窗，也可安装小功率的排风 扇。
• 6、使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取， 请用自动吸管或安全吸球。
• 仪器
• 1、使用仪器前先了解其性能、配置及正确操作方 法，零件及附件严禁拆卸，勿私自调整，并注意 插座电压（110V或220V）之类别。
• 2、使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡， 锁紧离心机转陀。冷冻离心机于开机状态时，务 必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。
• 4.2、用上述消毒过的器械，将切割好的外植体插 植到培养基表面上，具体操作是：
• (1)左手拿三角瓶，解开包头纸，将三角瓶几乎水 平拿着，靠近酒精灯焰，将瓶口外部在灯焰上燎 数秒钟，使瓶口的水气散发掉。
• (2)右手小指和无名指配合手掌将棉塞在灯焰附近 慢慢拔出，以免空气速向瓶内冲击，引起瓶口灰 尘等冲入，造成污染。
• 操作前用台内的酒精棉团擦拭手、手腕，再擦培 养基和超净工作台，一般按如下顺序擦拭培养瓶： 瓶的棉塞、瓶身、瓶底，彻底擦拭后放入超净工 作台。
• 4、接种操作
• 4.1、剪、镊消毒
• 每次取出时剪口并拢，不可接触磨口瓶和 其它器皿，并保持尖端向下;剪、镊分别在 酒精灯外焰彻底灼烧，烧时将剪口镊口张 开，烧至剪、镊上部，火焰熄灭后，插回 磨口瓶
实验操作须知
1、实验室设计与要求 • 实验室设计是由工作的目的和规模决定的，要
合理布局，通常按自然工作程序先后安排成一条 连续的生产线，避免有的环节倒排增加日后工作 的负担或引起混乱。房屋可规划为洗涤室、灭菌 室、配制室、无菌操作室、培养室、鉴定室、驯 化移栽室等。 • 1. 1准备室 • 需备有的设备有：鼓风干燥箱、落水架、工作 台、水池、水桶、水盆、试管刷等，主要用于玻 璃器皿、用具和培养材料清洗；还需要有高压水 龙头用于冲洗。 • 1.2灭菌室 • 需备有高压蒸汽灭菌装置、细菌过滤器、用于培 养基及培养器械的灭菌
染。 • （4）台外人员走动要轻、动作要小。 • （5）接种完毕后注意标明接种材料名称、日期、
处理。
• 5、培养器材的清洗
• 在细胞工程实验中，离体细胞对任何毒性物质都 十分敏感。毒性物质包括解体的微生物和细胞残 余物以及非营养的化学物质。某些化学物质仅 0.01μg/L就会对细胞产生毒性作用，因此对培养 器皿的清洗是组织培养中一项极为重要的环节。
• 4、有毒、致癌药剂例如acrylamide（神经 毒）、ethidium bromide（突变剂）、SDS、 秋水仙素请戴手套及口罩取用，并勿到处 污染，脱下手套后，应养成洗手的好习惯。
• 5、接触到病原材料或细菌，应迅速消毒。 所有被污染的物品，在丢弃或重复使用前 均需先灭菌，固体培养基不得倒入水槽或 下水道中。
• (3)棉塞始终夹在右手两手指之间，这时再将瓶口 在灯焰上旋转，使充分灼烧灭菌。
• (4)用右手大、食、中指拿镊子夹一块外植体送入 瓶内轻轻的插入培养基中，镊子灼烧后放回磨口 瓶，再把棉塞在灯焰上灼燎数秒，灼燎时应旋转， 避免烧坏，塞好棉塞，包上报纸，便完成了第一 瓶的操作，接着再做第二瓶，如此直到外植体全 部接完
• 3、皮肤、眼、鼻、咽喉受毒物侵害时，应立即用 大量自来水冲洗，然后送医院请各专科医生处理。
• 4、一度烧伤：只损伤表皮，皮肤呈红斑，微痛， 微肿，无水泡。如被化学药品烧伤，应立即用大 量水冲洗，除去残留在创面上的化学物质，并用 冷水浸沐伤处，可减轻疼痛，最后需要消毒，保 护创面不受感染。
• 5、二度烧伤：损伤表皮及真皮层，皮肤起水泡， 疼痛，水肿明显。创面如污染严重，先用清水或 生理盐水冲洗，再以1：1000新洁尔灭消毒，不 要挑破水泡，用消毒纱布轻轻包扎好，请医生治 疗。
• 6、超净工作台內的酒精有机溶剂及易燃物 （如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要远离 火苗，不可留置火焰燃烧，万一着火，应 力持镇定，沉着处理。酒精或乙醚等着火 时，应使用泡沫灭火剂或湿毛巾覆盖，勿 使用水冲洗。
• 7、使用震荡器震荡培养时，注意三角瓶务 必对称放置，并用橡皮筋等夹紧，勿使其 摇晃摔出台面，否则需拆开并清除玻璃碎 片与培养液。
• 8、电击伤：急救时首先使触电者脱离电源，为此 可拉下电闸或用木棍将触电者从电源上拨开。当 心别把触电者摔伤。断开电源后，检查伤员呼吸 和心跳情况，若呼吸停止，立即进行人工呼吸。 对心跳亦停止者要同时进行心脏挤压。电击伤比 较轻微者，很快能恢复健康，重者必需请医生治 疗。应该注意，触电者在进行急救时，一般不要 注射强心针和喝兴奋剂。
• 3、准备进台
• 进入接种室前，应先将手表、手镯、戒子、耳环 等放在室外，将手和手腕用肥皂洗净后才能进入 接种室，并用75%酒精纱布擦拭双手、双腕(此纱 布置于超净工作台外烧杯内，并适时注入酒精)之 后换上消毒的工作服、帽子、口罩(盖上鼻子和嘴、 着装时注意头发不得置于帽子外，袖口用皮筋扎 紧)，进入台内。
• 急救措施
• 1、急性呼吸系统中毒：应使中毒者迅速离开现场， 移到通风良好的地方，呼吸新鲜空气。如有休克、 虚脱或心肺机能不全，必须先作抗休克处理，如人 工呼吸、给予氧气、喝兴奋剂（如浓茶，咖啡）等。
• 2、经由口服而中毒：需立即用3-5%小苏打溶液或 1：5000高锰酸钾溶液洗胃，洗胃时要大量地喝， 边喝边使之呕吐，最简单的催吐办法是用手指或筷 子压舌根，或给中毒者喝少量（15-25毫升）1%硫 酸铜或硫酸锌溶液（催吐剂）。使之迅速将毒物吐 出。洗胃要反复进行多次，直至吐出物中基本无毒 物为止。再服解毒剂，一般解毒剂有鸡蛋清、牛奶、 淀粉糊、桔子汁等。另外有些特殊解毒剂专对某种 中毒而用。如磷中毒时用硫酸铜，钡中毒时用硫酸 钠，氰化物中毒时用硫代硫酸钠等。
• 3、实验时不要用潮湿有汗的手去操作电器，不要 用手紧握可能荷电的电器，不应以两手同时触及 电器，电器设备外壳均应接地。万一不慎发生触 电事故，应立即切断电源开关，对触电者采取急 救措施。
• 4、使用微波炉加热时，不可有铝箔等金属 物品，瓶盖必须松开，以免爆炸。加热后 戴防热手套取出瓶子。
• 5、使用UV灯时，不要以眼睛直视UV，应 隔着挡板观察，完毕立即关灯。
• (3)最好安置一小型空调机，使室内温度保持在 26℃左右，这样就可以在工作时或不工作时都把 工作室的门窗紧闭，保持与外界相对隔绝的状态， 尽量减少与外界的空气对流，减少尘埃与微生物 侵入。
• (4)经常采用消毒措施，达到较高的无菌水平，以 利完全操作提高工作的质量与效率。
• (5)无菌室外应留有缓冲间，进入无菌室前在此更 衣换鞋洗手及处理外界采回准备消毒培养的材料 等。
• 4、所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有， 不得带出实验室。每组分配的仪器、耗材请确定 清点与保管，课程结束后如数清点缴回。公用仪 器请善加爱惜使用，实验前后，请把工作区域清 理擦拭，并随时保持环境卫生。
• 5、实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及 操作规程，注意上课所告知的注意事项。实验进 行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变 更实验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随 即清理。实验后，确切记下自己的结果，严禁抄 袭，确定关闭不用的电源、水、酒精灯及煤气等。
• 室内应备有制冷设备、加热设备、控光设备、固 定式培养架、旋转式培养架、摇床等。
• 1.6鉴定室
• 需备有高倍显微镜、倒置显微镜、相差显 微镜、解剖镜、恒温箱、切片机、烤片台、 恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻 片等。
• 1.7驯化移植室
• 应备有温室、弥雾装置、荫棚、移植床、 钵、盆、塑料布、草炭、蛭石、粗沙等， 用于试管小植株的锻炼和移植。
• 2、新配制的试剂请清楚注明内溶物、浓度、 注意事事项及配制日期，为避免污染，勿 将未用完的药剂倒回容器内。
• 3、挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、 丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、mercaptoethanol、酚等）要在通风橱中戴 手套量取配制，取用完后随即盖好盖子， 若不小心打翻试剂，马上处理。
• 6、三度烧伤：损伤皮肤全层，包括皮下组织，肌 肉，骨骼，创面呈灰白色或焦黄色，无水泡，不 痛，感觉消失。在送医院前，主要防止感染和休 克，可用消毒纱布轻轻包扎好，给伤者保暖和供 氧，必要时注射吗啡止痛。
• 7、炸伤： 其急救措施基本同烧伤处理。但炸伤 后伤口往往大量出血，应立即将伤口上部扎紧， 防止流血过多。如发生昏迷、休克等，应进行人 工呼吸，给氧，并送医院治疗。
• 1.3配制室 • 需备有冰箱、化学实验台、药品柜、器械柜、
物品存放架以及各种玻璃器皿和用具，包括各种 不同容积的容量瓶、烧杯、量筒、移液管、三角 瓶、磨口瓶、广口瓶、各种类型培养瓶、玻璃棒、 移液管架、试管刷、电炉、微波炉等。 • 1.4无菌操作室(接种室) • 无菌操作室在工作方便的前提下，宜小不宜大， 宜精细密闭，忌粗陋放散，是植物组织培养研究 或生产工作中最关键的部分，关系到培养物的污 染率，接种工作效率等重要指标。要求如下: • (1)地面、天花板及四壁尽可能光洁、避免积染灰 尘，易于采取各种清洁措施。 • (2)干爽、安静、清洁明亮，在适当的位置吊装紫 外灯1-2盏，用以经常照射灭菌，使室内保持良好 的无菌、低密度有菌状态。
实验目录
• 实验室安全守则 • 实验操作须知 • 实验一、培养基母液的制备 • 实验二、培养基的配制与灭菌 • 实验三、培养材料灭菌和接种 • 实验四、愈伤组织的诱导与增殖 • 实验五、愈伤组织的分化 • 实验六、植物再生与快速繁殖 • 实验七、马铃薯茎尖脱毒 • 实验八、马铃薯试管微薯的诱导 • 实验九、植物细胞悬浮培养与同步化 • 实验十、植物细胞的生长计量技术 • 实验十一*、 细胞的分裂指数 • 实验十二*、 细胞周期的测定
• 6、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立 即停止实验。实验时间若延长，请注意时间的管 制及自身的安全，不可自行逗留实验室过夜。
• 7、实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关 闭灯光及电源，离开实验室前记得洗手。
• 8、任何意外事件应立即报告师长，并应熟知相关 的应急措施。
• 药品
• 1、使用任何药品，请先看清楚标示、注意 事项，翻阅物质安全资料表，查明是否对 人体造成伤害，使用完毕请放回原位。
无菌操作中必须遵守的事项：
• （1）棉塞不能乱放。手拿的部分限于棉塞膨大的 上半部分，塞入瓶口的那一段始终悬空，并不要 碰到其它任何物体；若是螺旋盖或薄膜，则应解 下放置在灭过菌的台面上，放置处应随时用酒精 棉团涂抹灭菌。
• （2）操作人员的头、胳膊等不得进入台内。 •wenku.baidu.com（3）操作人员不得随意谈话、说笑，以免造成污