RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展
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目前， 植物功能基因组学中通过反向遗传学 获得功能缺失突变体鉴定基因功能的方法主要包 括反义、共抑制、转座子诱变技术等 ［１］。虽然通过 这些技术已经成功鉴定了许多基因的功能， 但是 却存在着工作量大、非定向性和对多拷贝基因无 效等缺点， 限制了在植物功能基因组研究中的广 泛应用。因此， 急需开发新的快速简便、通用性 强、定向性强的获得功能缺失突变体的技术。以 ＲＮＡ 干 扰 为 机 理 的 转 基 因 ＲＮＡｉ 技 术 和 病 毒 介 导 的 基 因 沉 默 技 术（ Ｖｉｒｕｓ－ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ， ＶＩＧＳ） 应运而生。
１ ＲＮＡ干扰技术概述
ＲＮＡ 干扰（ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， ＲＮＡｉ） 是指 ｄｓＲＮＡ 分子引起的序列特异性降解靶基因 ｍＲＮＡ， 从而导 致内源靶基因沉默的机制。ＲＮＡｉ 首先发现于秀丽 隐杆线虫（ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ） 中， 将 ｄｓＲＮＡ 注入线虫体内 后发现可抑制序列同源基因的表达， 抑制主要作
第 ３８ 卷 第 １ 期 ２００７ 年 ２ 月 文章编号 １００５－ ９３６９（ ２００７） ０１－ ０１１９－ ０６
东北农业大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
３８（１）： １１９￣１２４ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００７
ＲＮＡｉ 技术在植物功能基因组学中的研究进展
图 ２ ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 和 ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 载体的克隆策略 Ｆｉｇ． ２ Ｍａｐ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒ ａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ ａｎｄ ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ
由图 ２ 可知， 来自于靶基因的 ＰＣＲ 产 物 克 隆 至 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 的多克隆位点上， 通过引物增加的 限制性酶切位点确保正义链及反义链臂部序列按着 正 确 的 方 向 构 建 到 载 体 上 。ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 载 体 上 的 ａｔｔＢ１ 和 ａｔｔＢ２ 序 列 使 正 义 及 反 义 序 列 的 重 组 过 程更加方便、快捷。ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 和 ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 的 全 序 列 及 注 释 可 在 ＥＭＢＬ 上 查 询 。（ Ａｃｃ Ｎｏ： ＡＪ３１１８７２ ａｎｄ ＡＪ３１１８７４） 。
构在较多情况下都具有高效性。若靶基因序列两臂 的 长 度 不 一 致 ， ｉｈｐＲＮＡ 结 构 末 端 有 未 配 对 碱 基 ， 则不影响基因沉默效率［３，１０］。 ２．１．２ 高通量载体的构建
为了高通量利用植物转基因 ＲＮＡｉ 技术， 研究者 构建了 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 和 ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 载体， 见图２。
由于小至 ２１ ｂｐ 的碱基同源就能引发 ＲＮＡｉ 机 制， 因此靶基因序列的位置选取至关重要， 如果根
据此规则， 想要沉默一个基因家族中的单独某个基 因须经过生物信息学方法进行同源性比对， 选取其 序列内部没有与其他基因具有同源性序列的片段， 或者同源片段的长度不超过 ２０ 个以上碱基来作为 ｉｈｐＲＮＡ 臂部序列； 若要沉默整个基因家族的基因， 只需构建一个载体， 选取这一基因家族的一段共有 的保守区序列片段作为 ｉｈｐＲＮＡ 臂 部 序 列 。 然 而 ， 这个规则仍然需要更多证据证实。若设计产生的 ｄｓＲＮＡ 序列较短， 则可以从靶基因转录本起始密码 子 ＡＵＧ 开始， 向下游寻找 ＡＡ 双核苷酸序列， 将此 双核苷酸序列和其下游相邻 １９ 个核苷酸作为序列 设计模板； 每个基因可选择特异性最强的 ４～５ 个 序列， 通过人工合成的方法作为载体的臂部结构。
收稿日期： ２００５－ １１－ ２８ 基金项目： 国 家 自 然 科 学 基 金（ ３０４７１０５０） 作者简介： 李丽文（ １９７８－） ， 女， 黑龙江人， 博士研究生， 研究 方向为植物分子生物学与植物 基 因 工 程 。Ｅ－ ｍａｉｌ： ｌｉｌｉｗｅｎ００７＠ｓｏｈｕ． ｃｏｍ ＊ 通讯作者 Ｅ－ ｍａｉｌ： ｙｍｚｈｕ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
因的表达产物对于大肠杆菌是致命的， 例如 ＤＨ５α（ 但不包括 ＤＢ３．１） 可确保两个 ｃｃｄＢ 基因都 被两个臂部序列置换的质粒才能存活。氯霉素抗性 基因确保重组质粒内含子被保留， 筛选阳性克隆更 加快捷。正向及反向引物进行 ＰＣＲ 扩增 ＥＳＴ 数据 库中的靶基因可模式化构建一些未知基因的 ｉｈｐＲＮＡ 结构载体。ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 是一个具高拷贝 数的双元载体， 重组体可直接转化农杆菌， 便于遗 传转化。此载体将被广泛作为一种高通量的构建 ｉｈｐＲＮＡ 结构模式系统［６，１３－１４］。 ２．１．３ 转基因 ＲＮＡｉ 技术的优缺点
ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 能 作 为 构 建 高 通 量 载 体 的 基 础 ， 但用 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 载体构建大量已知基因或未知基 因文库的载体就必须将每一个基因都按照正确的方 向 克 隆 到 发 夹 臂 序 列 位 置 ， 非 常 繁 锁 。 ｐＨＥＬＬ－ ＳＧＡＴＥ 克 服 了 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 载 体 的 缺 点 。 它 可 使 ＰＣＲ 产 物（ 两 端 带 有 ａｔｔＢ１ 和 ａｔｔＢ２ 识 别 位 点） 通 过 同 源 重 组 的 方 式 直 接 整 合 到 含 ａｔｔＰ１ 和 ａｔｔＰ２ 位 点 的质粒上， 构建成 ｉｈｐＲＮＡ 结构的两个臂。ｃｃｄＢ 基
技术方面， 包括载体结构的优化策略、高通量载体的构建方法以及该技术的优缺点。病毒介导的基因沉默技术方
面包括病毒载体及宿主种类， 病毒感染方法， 试验对照的建立、环境因素的影响以及该技术的优缺点。
关键词： ＲＮＡｉ； 转基因 ＲＮＡｉ； 病毒介导的基因沉默
中图分类号： Ｑ５２２
文献标识码： Ａ
功能基因组计划的最主要目的是鉴定基因组 中每一个基因的生物学功能。研究基因功能的方 法主要分为两类： 通过分析基因差异表达鉴定基 因功能和通过反向遗传学鉴定基因功能。
转基因 ＲＮＡｉ 技术是一种转录后水平的基因沉 默技术。通过构建可转录为 ｄｓＲＮＡ 的植物表达载 体， 获得表达构建序列的转基因植株， 分析目的基 因的功能。相对于反义及共抑制技术， 可获得更高 的基因沉默效率。转基因 ＲＮＡｉ 技术的表型观察以 及相关基因的功能分析常依赖于完整的个体， 因此
在植物功能基因组学中必须通过构建植物表达载 体， 进而获得转基因植株。 ２．１．１ 转基因 ＲＮＡｉ 技术载体结构的优化
它只降解与之序列相应的单个内源基因。 ｓｉＲＮＡ 除 正 义 链 上 ３＇ 端 的 两 个 碱 基 在 序 列 识 别 上 不起作用外， 其它碱基中任何一个改变都可能引起 ＲＮＡｉ 效应失效。 １．２．２ 高效性
１９９８ 年 Ｆｉｒｅ 等发现少量的 ｄｓＲＮＡ 就能够导致 线虫大量的靶 ｍＲＮＡ 降解， 表明 ＲＮＡｉ 机制中存在 信号放大的步骤， 且证明扩增机制由靶序列指导， 具有高效性和持久性 ［４］。 １．２．３ 信号的可传递性
李丽文， 朱延明＊， 李 杰， 柏 锡， 才 华
（ 东北农业大学生命科学学院， 黑龙江 哈尔滨 １５００３０ ）
摘 要： 文章主要综述了 ＲＮＡ 干涉（ ＲＮＡｉ） 技术在植物功能基因组学中的研究策略及研究现状， 包括 ＲＮＡ 干
涉的作用机制及技术特征， 引发植物 ＲＮＡｉ 机制的转基因 ＲＮＡｉ 技术以及病毒介导的基因沉默技术。转基因 ＲＮＡｉ
ＲＮＡｉ 信号在植物中可以通过两种途径在细胞 间传递， 主要有通过胞间连丝在细胞间短距离传递
· １２０ ·
东北农业大学学报
第 ３８ 卷
和通过植物维管系统进行长距离的传送［５］。
２ ＲＮＡｉ 技 术 在 植 物 功 能 基 因 组 学 中 的研究进展
ＲＮＡｉ 机制中 ｄｓＲＮＡ 最初的起源， 在病毒感染 植物的情况下， 认为 ｄｓＲＮＡ 与 ＲＮＡ 病毒核酸复制 密 切 相 关 ； 对 于 转 基 因 ， ｄｓＲＮＡ 可 能 通 过 宿 主 ＲＮＡ 依赖的 ＲＮＡ 聚合体的活动产生， 转基因的插 入或者重排形成的转录后 ＲＮＡ 序列一前一后的反 向重复插入也可能会产生 ｄｓＲＮＡ； 或被特殊设计成 产生 ｄｓＲＮＡ 也可能会引发 ＰＴＧＳ。目前， 在植物中 根据不同的实验情况及不同的 ｄｓＲＮＡ 的来源， 主 要有两种技术方法引发 ＲＮＡｉ 机制， 其一是转基因 ＲＮＡｉ 技术， 其二是病毒介导的基因沉默（ ＶＩＧＳ） 。 ２．１ 转基因 ＲＮＡｉ 技术在植物中的研究进展
优化载体对于转基因 ＲＮＡｉ 技术是否能够获得 有效沉默效率至关重要。将载体设计成反向重复序 列 可 使 表 达 的 单 链 ＲＮＡ 自 我 配 对 形 成 发 夹 结 构 ＲＮＡ（ ｈｐＲＮＡ） ， ｈｐＲＮＡ 具 有 引 发 ＲＮＡｉ 机 制 的 ｄｓＲＮＡ 结构 ［６］。ｈｐＲＮＡ 载体设计策略是将要沉默的 靶基因的一段序列反向重复连接在启动子和终止子 之间。预测其表达的 ＲＮＡ 形成 ｈｐＲＮＡ 结构， 即形 成 ｄｓＲＮＡ 结构。ｈｐＲＮＡ 结构的正反向重复序列之 间需存在一段间隔区， 通常转录正义链及反义链其 沉 默 效 率 仅 为 １０％左 右 ， 但 是 带 有 间 隔 区 结 构 的 ｈｐＲＮＡ 载 体 ， 其 沉 默 效 率 可 达 到 ５０％［７－８］。 而 用 正 义方向连接的内含子序列替代 ｈｐＲＮＡ 间隔区， 形 成带有内含子结构的 ｉｈｐＲＮＡ 载体， 其沉默效率可 达 到 ９０％以 上 ， 甚 至 是 １００％［９］。 说 明 内 含 子 能 够 增强转基因沉默效率， 原因可能是内含子在经过转 录后被剪切掉， 使具有反向 重 复 序 列 的 单 链 ＲＮＡ 在空间上更加接近， 更 易 配 对 形 成 双 链 ， ｉｈｐＲＮＡ 结构比 ｈｐＲＮＡ 结构更具稳定性（ 见图１） 。
用 于 转 录 之 后 ［２］。 随 后 陆 续 在 果 蝇 、 拟 南 芥 和 人 体 内发现了 ＲＮＡｉ 现 象 。ＲＮＡｉ 是 真 核 生 物 中 一 种 普 遍存在且非常保守的机制， 与许多重要生物学过程 密切相关。 １．１ ＲＮＡｉ 作用机制
ＲＮＡｉ 是 一 个 依 赖 ＡＴＰ 的 过 程 ， 首 先 ｄｓＲＮＡ 被一种称为 Ｄｉｃｅｒ 的核酸酶降解为长 ２１￣２３ ｂｐ 小干 扰 ＲＮＡ（ ｓｉＲＮＡ） ， ｓｉＲＮＡ ５＇ 末端具有单磷酸、３＇ 末 端有一个 ２￣３ ｎｔ 的单链突出， ｓｉＲＮＡ 形成之后， 与 一 系 列 特 异 性 蛋 白 结 合 形 成 ｓｉＲＮＡ 诱 导 干 扰 复 合 体（ ｓｉＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｘ， ＲＩＳＣ） ， 通过 碱基互 补 配 对 识 别 具 同 源 序 列 的 靶 ｍＲＮＡ 并 使 其 降解， 从而导致特定基因的沉默［３］。 １．２ ＲＮＡｉ 技术特征 １．２．１ 高度特异性
ｍＲＮＡ 的 ５＇ 端和 ３＇ 端非翻译区及起始密码子
第１期
李丽文等： ＲＮＡｉ 技术在植物功能基因组学中的研究进展
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附近序列作为 ｉｈｐＲＮＡ 载体的臂部结构， 可能会因 为 这 些 区 域 的 调 节 蛋 白 与 ＲＩＳＣ 竞 争 结 合 靶 序 列 ， 而 降 低 ｓｉＲＮＡ 的 基 因 沉 默 效 应 。 但 仍 有 许 多 研 究 结果显示， ｉｈｐＲＮＡ 载体对于靶基因序列的位置的 选取无论是靶基因的编码保守区， ３＇ 非翻译区， 还 是 ５＇ 非 翻 译 区 序 列 都 同 样 有 效 ， 表 明 ｉｈｐＲＮＡ 结
图 １ ｉｈｐＲＮＡ 载体结构 Ｆｉｇ． １ Ｓｔｒ ｕｃｔｕｒ ｅ ｏｆ ｉｈｐＲＮＡ ｖｅｃｔｏｒ
ห้องสมุดไป่ตู้
报道表明， 在植物中， ｉｈｐＲＮＡ 载体在靶序列 臂长度为 ９８～８５３ ｂｐ 范围内 可 达 到 较 高 的 沉 默 效 率 ， 其 转 化 体 沉 默 效 率 可 达 ６６％ ～１００％（ 平 均 ９０％） ［１０］。在果蝇中 ＲＮＡｉ 机制可以被 ２１ ｂｐ 长度的 ｄｓＲＮＡ 所引发， 植物中也发现类似的 ２１～２５ ｂｐ 长 度的 ｄｓＲＮＡ。分析 推 测 ｍＲＮＡ 之 间 同 源 性 的 最 小 长度也就是引发的 ＲＮＡｉ 机制有效的 ｉｈｐＲＮＡ 结构 的臂长是 ２１～２５ ｂｐ［１１］。虽小至 ２１ ｂｐ 的长度有时就 可引发沉默， 但通常更长的特异序列才能保证引发 基因沉默， 可能存在几种因素： 靶序列的核酸组 成 ； ｓｉＲＮＡ 的 热 力 学 性 质［１２］； 靶 序 列 的 热 力 学 性 质。对有效引发基因沉默都起着至关重要的作用。
１ ＲＮＡ干扰技术概述
ＲＮＡ 干扰（ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， ＲＮＡｉ） 是指 ｄｓＲＮＡ 分子引起的序列特异性降解靶基因 ｍＲＮＡ， 从而导 致内源靶基因沉默的机制。ＲＮＡｉ 首先发现于秀丽 隐杆线虫（ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ） 中， 将 ｄｓＲＮＡ 注入线虫体内 后发现可抑制序列同源基因的表达， 抑制主要作
第 ３８ 卷 第 １ 期 ２００７ 年 ２ 月 文章编号 １００５－ ９３６９（ ２００７） ０１－ ０１１９－ ０６
东北农业大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
３８（１）： １１９￣１２４ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００７
ＲＮＡｉ 技术在植物功能基因组学中的研究进展
图 ２ ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 和 ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 载体的克隆策略 Ｆｉｇ． ２ Ｍａｐ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒ ａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ ａｎｄ ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ
由图 ２ 可知， 来自于靶基因的 ＰＣＲ 产 物 克 隆 至 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 的多克隆位点上， 通过引物增加的 限制性酶切位点确保正义链及反义链臂部序列按着 正 确 的 方 向 构 建 到 载 体 上 。ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 载 体 上 的 ａｔｔＢ１ 和 ａｔｔＢ２ 序 列 使 正 义 及 反 义 序 列 的 重 组 过 程更加方便、快捷。ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 和 ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 的 全 序 列 及 注 释 可 在 ＥＭＢＬ 上 查 询 。（ Ａｃｃ Ｎｏ： ＡＪ３１１８７２ ａｎｄ ＡＪ３１１８７４） 。
构在较多情况下都具有高效性。若靶基因序列两臂 的 长 度 不 一 致 ， ｉｈｐＲＮＡ 结 构 末 端 有 未 配 对 碱 基 ， 则不影响基因沉默效率［３，１０］。 ２．１．２ 高通量载体的构建
为了高通量利用植物转基因 ＲＮＡｉ 技术， 研究者 构建了 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 和 ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 载体， 见图２。
由于小至 ２１ ｂｐ 的碱基同源就能引发 ＲＮＡｉ 机 制， 因此靶基因序列的位置选取至关重要， 如果根
据此规则， 想要沉默一个基因家族中的单独某个基 因须经过生物信息学方法进行同源性比对， 选取其 序列内部没有与其他基因具有同源性序列的片段， 或者同源片段的长度不超过 ２０ 个以上碱基来作为 ｉｈｐＲＮＡ 臂部序列； 若要沉默整个基因家族的基因， 只需构建一个载体， 选取这一基因家族的一段共有 的保守区序列片段作为 ｉｈｐＲＮＡ 臂 部 序 列 。 然 而 ， 这个规则仍然需要更多证据证实。若设计产生的 ｄｓＲＮＡ 序列较短， 则可以从靶基因转录本起始密码 子 ＡＵＧ 开始， 向下游寻找 ＡＡ 双核苷酸序列， 将此 双核苷酸序列和其下游相邻 １９ 个核苷酸作为序列 设计模板； 每个基因可选择特异性最强的 ４～５ 个 序列， 通过人工合成的方法作为载体的臂部结构。
收稿日期： ２００５－ １１－ ２８ 基金项目： 国 家 自 然 科 学 基 金（ ３０４７１０５０） 作者简介： 李丽文（ １９７８－） ， 女， 黑龙江人， 博士研究生， 研究 方向为植物分子生物学与植物 基 因 工 程 。Ｅ－ ｍａｉｌ： ｌｉｌｉｗｅｎ００７＠ｓｏｈｕ． ｃｏｍ ＊ 通讯作者 Ｅ－ ｍａｉｌ： ｙｍｚｈｕ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
因的表达产物对于大肠杆菌是致命的， 例如 ＤＨ５α（ 但不包括 ＤＢ３．１） 可确保两个 ｃｃｄＢ 基因都 被两个臂部序列置换的质粒才能存活。氯霉素抗性 基因确保重组质粒内含子被保留， 筛选阳性克隆更 加快捷。正向及反向引物进行 ＰＣＲ 扩增 ＥＳＴ 数据 库中的靶基因可模式化构建一些未知基因的 ｉｈｐＲＮＡ 结构载体。ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ 是一个具高拷贝 数的双元载体， 重组体可直接转化农杆菌， 便于遗 传转化。此载体将被广泛作为一种高通量的构建 ｉｈｐＲＮＡ 结构模式系统［６，１３－１４］。 ２．１．３ 转基因 ＲＮＡｉ 技术的优缺点
ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 能 作 为 构 建 高 通 量 载 体 的 基 础 ， 但用 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 载体构建大量已知基因或未知基 因文库的载体就必须将每一个基因都按照正确的方 向 克 隆 到 发 夹 臂 序 列 位 置 ， 非 常 繁 锁 。 ｐＨＥＬＬ－ ＳＧＡＴＥ 克 服 了 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 载 体 的 缺 点 。 它 可 使 ＰＣＲ 产 物（ 两 端 带 有 ａｔｔＢ１ 和 ａｔｔＢ２ 识 别 位 点） 通 过 同 源 重 组 的 方 式 直 接 整 合 到 含 ａｔｔＰ１ 和 ａｔｔＰ２ 位 点 的质粒上， 构建成 ｉｈｐＲＮＡ 结构的两个臂。ｃｃｄＢ 基
技术方面， 包括载体结构的优化策略、高通量载体的构建方法以及该技术的优缺点。病毒介导的基因沉默技术方
面包括病毒载体及宿主种类， 病毒感染方法， 试验对照的建立、环境因素的影响以及该技术的优缺点。
关键词： ＲＮＡｉ； 转基因 ＲＮＡｉ； 病毒介导的基因沉默
中图分类号： Ｑ５２２
文献标识码： Ａ
功能基因组计划的最主要目的是鉴定基因组 中每一个基因的生物学功能。研究基因功能的方 法主要分为两类： 通过分析基因差异表达鉴定基 因功能和通过反向遗传学鉴定基因功能。
转基因 ＲＮＡｉ 技术是一种转录后水平的基因沉 默技术。通过构建可转录为 ｄｓＲＮＡ 的植物表达载 体， 获得表达构建序列的转基因植株， 分析目的基 因的功能。相对于反义及共抑制技术， 可获得更高 的基因沉默效率。转基因 ＲＮＡｉ 技术的表型观察以 及相关基因的功能分析常依赖于完整的个体， 因此
在植物功能基因组学中必须通过构建植物表达载 体， 进而获得转基因植株。 ２．１．１ 转基因 ＲＮＡｉ 技术载体结构的优化
它只降解与之序列相应的单个内源基因。 ｓｉＲＮＡ 除 正 义 链 上 ３＇ 端 的 两 个 碱 基 在 序 列 识 别 上 不起作用外， 其它碱基中任何一个改变都可能引起 ＲＮＡｉ 效应失效。 １．２．２ 高效性
１９９８ 年 Ｆｉｒｅ 等发现少量的 ｄｓＲＮＡ 就能够导致 线虫大量的靶 ｍＲＮＡ 降解， 表明 ＲＮＡｉ 机制中存在 信号放大的步骤， 且证明扩增机制由靶序列指导， 具有高效性和持久性 ［４］。 １．２．３ 信号的可传递性
李丽文， 朱延明＊， 李 杰， 柏 锡， 才 华
（ 东北农业大学生命科学学院， 黑龙江 哈尔滨 １５００３０ ）
摘 要： 文章主要综述了 ＲＮＡ 干涉（ ＲＮＡｉ） 技术在植物功能基因组学中的研究策略及研究现状， 包括 ＲＮＡ 干
涉的作用机制及技术特征， 引发植物 ＲＮＡｉ 机制的转基因 ＲＮＡｉ 技术以及病毒介导的基因沉默技术。转基因 ＲＮＡｉ
ＲＮＡｉ 信号在植物中可以通过两种途径在细胞 间传递， 主要有通过胞间连丝在细胞间短距离传递
· １２０ ·
东北农业大学学报
第 ３８ 卷
和通过植物维管系统进行长距离的传送［５］。
２ ＲＮＡｉ 技 术 在 植 物 功 能 基 因 组 学 中 的研究进展
ＲＮＡｉ 机制中 ｄｓＲＮＡ 最初的起源， 在病毒感染 植物的情况下， 认为 ｄｓＲＮＡ 与 ＲＮＡ 病毒核酸复制 密 切 相 关 ； 对 于 转 基 因 ， ｄｓＲＮＡ 可 能 通 过 宿 主 ＲＮＡ 依赖的 ＲＮＡ 聚合体的活动产生， 转基因的插 入或者重排形成的转录后 ＲＮＡ 序列一前一后的反 向重复插入也可能会产生 ｄｓＲＮＡ； 或被特殊设计成 产生 ｄｓＲＮＡ 也可能会引发 ＰＴＧＳ。目前， 在植物中 根据不同的实验情况及不同的 ｄｓＲＮＡ 的来源， 主 要有两种技术方法引发 ＲＮＡｉ 机制， 其一是转基因 ＲＮＡｉ 技术， 其二是病毒介导的基因沉默（ ＶＩＧＳ） 。 ２．１ 转基因 ＲＮＡｉ 技术在植物中的研究进展
优化载体对于转基因 ＲＮＡｉ 技术是否能够获得 有效沉默效率至关重要。将载体设计成反向重复序 列 可 使 表 达 的 单 链 ＲＮＡ 自 我 配 对 形 成 发 夹 结 构 ＲＮＡ（ ｈｐＲＮＡ） ， ｈｐＲＮＡ 具 有 引 发 ＲＮＡｉ 机 制 的 ｄｓＲＮＡ 结构 ［６］。ｈｐＲＮＡ 载体设计策略是将要沉默的 靶基因的一段序列反向重复连接在启动子和终止子 之间。预测其表达的 ＲＮＡ 形成 ｈｐＲＮＡ 结构， 即形 成 ｄｓＲＮＡ 结构。ｈｐＲＮＡ 结构的正反向重复序列之 间需存在一段间隔区， 通常转录正义链及反义链其 沉 默 效 率 仅 为 １０％左 右 ， 但 是 带 有 间 隔 区 结 构 的 ｈｐＲＮＡ 载 体 ， 其 沉 默 效 率 可 达 到 ５０％［７－８］。 而 用 正 义方向连接的内含子序列替代 ｈｐＲＮＡ 间隔区， 形 成带有内含子结构的 ｉｈｐＲＮＡ 载体， 其沉默效率可 达 到 ９０％以 上 ， 甚 至 是 １００％［９］。 说 明 内 含 子 能 够 增强转基因沉默效率， 原因可能是内含子在经过转 录后被剪切掉， 使具有反向 重 复 序 列 的 单 链 ＲＮＡ 在空间上更加接近， 更 易 配 对 形 成 双 链 ， ｉｈｐＲＮＡ 结构比 ｈｐＲＮＡ 结构更具稳定性（ 见图１） 。
用 于 转 录 之 后 ［２］。 随 后 陆 续 在 果 蝇 、 拟 南 芥 和 人 体 内发现了 ＲＮＡｉ 现 象 。ＲＮＡｉ 是 真 核 生 物 中 一 种 普 遍存在且非常保守的机制， 与许多重要生物学过程 密切相关。 １．１ ＲＮＡｉ 作用机制
ＲＮＡｉ 是 一 个 依 赖 ＡＴＰ 的 过 程 ， 首 先 ｄｓＲＮＡ 被一种称为 Ｄｉｃｅｒ 的核酸酶降解为长 ２１￣２３ ｂｐ 小干 扰 ＲＮＡ（ ｓｉＲＮＡ） ， ｓｉＲＮＡ ５＇ 末端具有单磷酸、３＇ 末 端有一个 ２￣３ ｎｔ 的单链突出， ｓｉＲＮＡ 形成之后， 与 一 系 列 特 异 性 蛋 白 结 合 形 成 ｓｉＲＮＡ 诱 导 干 扰 复 合 体（ ｓｉＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｘ， ＲＩＳＣ） ， 通过 碱基互 补 配 对 识 别 具 同 源 序 列 的 靶 ｍＲＮＡ 并 使 其 降解， 从而导致特定基因的沉默［３］。 １．２ ＲＮＡｉ 技术特征 １．２．１ 高度特异性
ｍＲＮＡ 的 ５＇ 端和 ３＇ 端非翻译区及起始密码子
第１期
李丽文等： ＲＮＡｉ 技术在植物功能基因组学中的研究进展
· １２１ ·
附近序列作为 ｉｈｐＲＮＡ 载体的臂部结构， 可能会因 为 这 些 区 域 的 调 节 蛋 白 与 ＲＩＳＣ 竞 争 结 合 靶 序 列 ， 而 降 低 ｓｉＲＮＡ 的 基 因 沉 默 效 应 。 但 仍 有 许 多 研 究 结果显示， ｉｈｐＲＮＡ 载体对于靶基因序列的位置的 选取无论是靶基因的编码保守区， ３＇ 非翻译区， 还 是 ５＇ 非 翻 译 区 序 列 都 同 样 有 效 ， 表 明 ｉｈｐＲＮＡ 结
图 １ ｉｈｐＲＮＡ 载体结构 Ｆｉｇ． １ Ｓｔｒ ｕｃｔｕｒ ｅ ｏｆ ｉｈｐＲＮＡ ｖｅｃｔｏｒ
ห้องสมุดไป่ตู้
报道表明， 在植物中， ｉｈｐＲＮＡ 载体在靶序列 臂长度为 ９８～８５３ ｂｐ 范围内 可 达 到 较 高 的 沉 默 效 率 ， 其 转 化 体 沉 默 效 率 可 达 ６６％ ～１００％（ 平 均 ９０％） ［１０］。在果蝇中 ＲＮＡｉ 机制可以被 ２１ ｂｐ 长度的 ｄｓＲＮＡ 所引发， 植物中也发现类似的 ２１～２５ ｂｐ 长 度的 ｄｓＲＮＡ。分析 推 测 ｍＲＮＡ 之 间 同 源 性 的 最 小 长度也就是引发的 ＲＮＡｉ 机制有效的 ｉｈｐＲＮＡ 结构 的臂长是 ２１～２５ ｂｐ［１１］。虽小至 ２１ ｂｐ 的长度有时就 可引发沉默， 但通常更长的特异序列才能保证引发 基因沉默， 可能存在几种因素： 靶序列的核酸组 成 ； ｓｉＲＮＡ 的 热 力 学 性 质［１２］； 靶 序 列 的 热 力 学 性 质。对有效引发基因沉默都起着至关重要的作用。