管碟法测定抗生素效价演示文稿

制保藏用菌株
•将营养肉汤培养物，用接种针沾取菌苔（菌液），沿半固体 培养基中心向管底作直线穿刺。穿刺到保藏管中，同样温度 35-37度，培养18-24h，然后，放置2-8度冰箱保存，作为保 藏及传代用的菌株。
制工作用菌悬液 试验用菌种穿刺管1支，按无菌操作要求，接种于盛有30ml 普通琼脂培养基的大三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养 基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入消毒液中。 将已接种的三角瓶置35～37℃的培养箱中培养7～10天，用 革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml 洗下芽孢，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得。置 5℃冰箱中保存。
流程图
冻干菌粉 营养肉汤
（复活）
半固体琼脂斜面
制菌悬液
穿刺管（保藏及传代用）
备注：每经过一次培养箱培养，菌的代数就增加一代。 参考：《药品微生物学检验技术》主编：苏德模 马绪荣 2007年出版
1.复活
从菌种保藏机构购回的标 准菌株，是冷冻干燥粉，需 经过复活。（冻干菌种为第0 代）
无菌操作，将冷冻干燥菌种安瓿用75%乙醇消毒后，用砂轮 在安瓿颈部刻线，用无菌纱布掰开，或灼热安瓿顶部，立即 作灭菌湿纱布盖住顶部，安瓿顶部便骤然裂开，小心移去玻 璃碎片，用一无菌毛细管吸取0.5-1ml适宜的液体培养基，直 插安瓿底部，挤出营养肉汤培养基，在底部振摇使菌粉溶解 ，再将安瓿内菌液吸出，接种至营养肉汤培养基。35-37度 培养18-24小时。（此为第一代）
3 菌液制备 根据中国药典2010年版二部附录要求，硫酸庆大霉素和硫酸 庆大霉素颗粒测效价，选取短小芽孢杆菌作为试验菌。
取短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202]的营养琼脂斜面培养物，接 种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日 ，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水 将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
• ⑵Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构 收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，细胞壁透性加大，结晶 紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后菌体呈红色为革兰阴 性菌。
革兰染色注意事项
1.革兰染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰阳性 菌也可被脱色而被误认为革兰阴性菌；如脱色时间过短， 革兰阴性菌也会被误认为是革兰阳性菌。因此必须严格把 握脱色时间。
在中国药典2010年版二部附录Ⅺ抗生素微生物检定法及 2015版药典中，详细描述了管碟法和浊度法测定抗生素 效价的方法，根据公司生产及检测情况，主要是硫酸庆 大霉素和硫酸庆大霉素颗粒，采用抗生素管碟法测效价 来计算含量，因此，此章主要介绍管碟法。
抗菌活性
•抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生物的能力。 •抗生素的抗菌活性通常用效价来表示。 •在临床应用中，抗生素的抗菌活性可准确地反应抗生素的医 疗价值。
• 当培养到一定时间，琼脂培养基的两种互动作用达到动态 平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌 圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制， 此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好 等于抗生素最低抑菌浓度。
量反应平行线原理：当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线 关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准 品的两条量-反应关系曲线相互平行。（中国药典二部附录XIV 生物检定统计法）
如：硫酸链霉素 798单位/毫克 青霉素G钠 1670单位/毫克
2 基本原理 2010版药典二部附录及2015版药典，在适宜条件下，根据量 反应平行线原理，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用， 比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小 ，测定供试品的效价。
抑菌圈的形成
• 两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩 散作用；另一种是试验菌的生长作用。
管碟法测定抗生素效价演 示文稿
（优选）管碟法测定抗生素效价
1 概述
抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生 素效价测定方法。随着HPLC等化学分析技术的发展， 一些抗生素效价的测定已被化学方法所替代，但由 于以下原因，抗生素微生物检定法，目前在各国药 典中仍占有重要地位。
1.微生物检定法可直观、特异的反应出抗生素药品 的抗菌活性，显示临床的特点。 2.多组分抗生素由于不同组分生物活性的差异，化 学测定结果难以准确表征组分、组成、含量和活性 的关系。 3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化 学分析方法表征其活性。 4.同时微生物法所需的仪器设备简单，成本低。
革兰染色法
• 具体操作步骤： • ⑴涂片 • ⑵干燥（自然干燥、培养箱内） • ⑶固定（火焰） • ⑷染色（包含初染、媒染、脱色、复染四步）
涂片
染色
初染：草酸铵结晶紫染1分钟，自来水冲洗。 媒染：加碘液覆盖涂面染1分钟，自来水冲洗。 脱色：加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒 后自来水冲洗。 复染：加沙黄（复红）复染液30秒后，自来水冲洗 。 自然干燥或用吸水纸吸去水分，镜检。 染色的结果：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红 色。
2.选用培养18～24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于 菌体死亡或自溶常使革兰阳性菌转呈阴性菌。
革兰染色结果
革兰染色结果
4 基本操作及注意事项
管碟法的操作步骤
预试验 品、
试验准备
双碟的制备
供试
标准品溶液的制备
菌层的制备
放置小钢管
滴加抗生素溶 液
双碟的培养
结果的可 靠性检验及效价测定
抑菌圈的测量
图片染色步骤
盐 水
涂片
干燥 镜检
复染
30s
接 种 环 自然干燥
固定
草酸 铵结 晶紫
初染
1min
复 红
脱色 30s
95% 乙醇 媒染
1min
碘 液
革兰染色原理
• 由于细菌细胞壁的结构和组成不同，将细菌分为革兰阳性 菌和革兰阴性菌。
• ⑴G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性孔障， 当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，透性降低,故保留 结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保留在细胞膜上，菌体呈紫 色为革兰阳性菌。
预Βιβλιοθήκη Baidu验：
确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗 生素浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定，即二 剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～ 22mm,三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈 直径在15～18mm. 高低剂量之比为2:1.