微生物学课程论文

土壤微生物主要类群的分离、记数及形态特征比较

生命科学学院级专业：生物工程姓名：

指导教师无

摘要：本实验是微生物学综合性实验项目，包含了微生物学实验中的微生物的分离和纯化、微生物的选择性培养、平板菌落计数（即活菌计数）、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物主要类群的培养特征和形态特征、制片染色技术等。[1]本文记录了对采自校园附近农田的土样中微生物主要类群的分离和纯化等试验操作方法和结果。所采每克土样中几种不同类群微生物的含量分别为：细菌6.63*107个、放线菌7.38*105个、霉菌2.33*104个，说明土壤中微生物种类的繁多和数量的庞大。培养基的种类和组分的不同可用于分离或富集不同的微生物。

关键词：分离纯化平板菌落计数微生物的形态

1.前言：

（1）、微生物在自然界及其在土壤中的分布简况；

微生物因其体积小、重量轻和数量多等原因，可以到处传播以致达到“无孔不入”的地步，只要条件合适，它们就可“随遇而安”。地球上除了火山的中心区域等少数地方外，从土壤圈、水圈、大气圈至岩石圈，到处都有它们的踪迹。

由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”，对人类来说，则是最丰富的菌种资源库。尽管土壤的类型众多，其中各种微生物的含量变化很大，但一般来说，在每克耕作层土壤中，各种微生物含量之比大体有一个10倍系列的递减规律：细菌（~108）>放线菌（~107，孢子）>霉菌（~106，孢子）>酵母菌（~105）>藻类（~104）>原生动物（~103）

（2）、土壤中各种类群的微生物的含量的大致情况；

土壤微生物包括细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物5大类群。是土壤生物中数量最多的一类。

细菌每克表层土壤中约含细菌几百万至几千万个，是土壤菌类中数量最多的一个类群;放线菌,每克表层土壤约含放线菌几十万至几千万个，是数量上仅次于细菌的一个类群;真菌,每克表层土壤只含真菌几千至几十万个，是土壤菌类中数量最少的一个类群，但其生物量〔指每平方米面积中菌体的重量（克）〕高于细菌和放线菌;藻类,直径3～50微米,喜湿，多栖居于土壤表面或表土层中，数量较菌类少。土壤中常见的有绿藻、蓝藻和硅藻。蓝藻中有的种类能固定空气中的氮素。

（3）、土壤中的微生物的作用；

土壤微生物在土壤中的作用是多方面的，土壤微生物的区系组成、生物量及其生命活动对土壤的形成和发育有密切关系。同时,土壤作为微生物的生态环境,也影响微生物在土壤中的消长和活性。并参与土壤有机物质的矿化和腐殖质化过程；同时通过同化作用合成多糖类和其他复杂有机物质，影响土壤的结构和耕性。土壤微生物的代谢产物还能促进土壤中难溶性物质的溶解。微生物参与土壤中各种物质的氧化－还原反应，对营养元素的有效化也有一定作用。参与土壤中营养元素的循环，包括碳素循环、氮素循环和矿物元素循环，促进植物营养元素的有效性。某些微生物有固氮作用，可借助其体内的固氮酶将空气中的游离氮分子转化为固定态氮化物。与植物根部营养关系密切。植物根际微生物以及与植物共生的微生物如根瘤菌、菌根和真菌等能为植物直接提供氮素、磷素和其他矿质元素的营养以及各种有机

营养，如有机酸、氨基酸、维生素、生长刺激素等。能为工农业生产和医药卫生事业提供有效菌种，培育高效菌系，如已在农业上应用的有根瘤菌剂、固氮菌剂和抗生菌剂等。某些抗生性微生物能防治土传病原菌对作物的危害。降解土壤中残留的有机农药、城市污物和工厂废弃物等，降低残毒为害。某些微生物可用于沼气发酵，提供生物能源、发酵液和残渣有机肥料。

（4）、本实验的主要过程和实验结果，对实验结果的简单说明和分析，通过实验得到的结论等。

本实验通过采样、选择性培养、平板菌落计数(即活菌计数)、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、等方法，对土壤中的微生物进行分离计数，并通过革兰氏染色等实验观察方法对微生物个体形态等进行培养与观察，以及制片染色技术等。结果发现土壤中微生物的含量极为丰富，含有霉菌，细菌，放线菌菌种。通过比较对微生物形态等有所进一步的了解与认识。

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1土样：以无菌方式采于学校内小园林，置于无菌容器中，待检

2.1.2培养基

2.1.2.1营养琼脂（牛肉膏蛋白胨固体培养基）[1]:牛肉膏3g/L

蛋白胨10g/L

NaCI5g/L

琼脂15-20g/L

水500ml

pH 7.0-7.2

121℃灭菌20min

2.1.2.2高氏一号固体培养基1[1]：可溶性淀粉20g/L

硝酸钾1g/L氯化钠0.5g/L

磷酸氢二钾0.5g/L硫酸镁0.5g/L

硫酸亚铁0.01g/L

琼脂20g/L

水500ml

pH 7.2-7.4 配置时，先用少量冷水，把淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至500ml ，121℃灭菌20min,灭菌后，在100ml 培养基中加入10%酚溶液5滴（作为抑制剂，以抑制细菌的生长），制备平板备用。

2.1.2.3查氏固体培养基[1]：硝酸钠2g/L

磷酸氢二钾1g/L

硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g

氯化钾0.5g/L

硫酸亚铁0.01g/L

蔗糖30g/L琼脂15-20g/L

水500mL

pH自然

分装后121℃灭菌20min

2.1.2.4马丁氏培养基：[1]：KH2PO4 1g/L

MgSO4·7H2O 0．5g/L

蛋白胨 5g/L

葡萄糖 10g/L

琼脂 15—20g/L

蒸馏水 500ml

pH 自然

1/3000孟加拉红水溶液33mg/L

121℃灭菌30min 临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml,使每毫升培养基中含链霉素30ug 2.1.2.5无菌水：装有90ml蒸馏水和数拾粒玻璃珠的250ml锥形瓶一只，装有9ml蒸馏水的18×180mm 试管数支；121.3℃，20分钟灭菌，备用

2.1.3染色液

2.1.

3.1革兰氏染色液[1]草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液等

2.1.

3.2 0.1%美蓝[1]用于放线菌菌丝形态观察

2.1.

3.3乳酸石炭酸棉蓝液[1] A液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g

95%酒精 10ml

B液：石炭酸 5．0g

蒸馏水 95ml

将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。

将石炭酸溶解于水中，配成B液。

混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。用于霉菌形态观察

2.2方法

2.2.1制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使土样与水充分混合，将细胞分散。静置，成为土壤悬液(10-1)。用1mL的无菌吸头从中吸取1mL 土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀(10-2)。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中(10-3)，依此类推制成10-4，10-5，10-6，10-6各种稀释度的土壤溶液。

2.2.2制备及涂布平板

用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-7、10-6和10-5的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的2.1.2.1平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。

用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-6、10-5和10-4的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的2.1.2.2平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。