哺乳动物细胞培养简述

哺乳动物细胞培养简述
1 前言
细胞培养是指通过模拟机体内的生理条件，将从生物机体内取出的器官、组织或细胞等，在体外进行培养，并使其继续生存、生长和繁殖的过程。

严格而言，细胞培养的对象不仅指各种动物细胞，同时也包含植物细胞，本手册主要讨论动物细胞培养的相关内容，简称细胞培养。

现代的动物细胞培养始于1907年，动物学家R.G. Harrison应用淋巴液做培养基，在无菌条件下成功培养了蝌蚪的神经板，并观察到神经细胞突起生长的过程；20世纪40年代末、50年代初，得益于抗生素、胰酶以及各种标准培养基的开发、使用，细胞培养技术取得迅速发展，至20世纪60年代，各大公司陆续推出各种适宜细胞生长的容器（瓶、皿、板等），同时进一步改善了细胞培养相关的仪器、试剂等，细胞培养逐渐成为现代生物研究的基本技术之一，广泛应用于现代生物医学和生物科学研究的各个方面。

细胞培养是研究细胞生命活动规律的一种简单易行的技术，其主要优点如下：
（1）培养对象是活的细胞，并且能够实现较好的均一性和线性放大，适宜于各种规模的研究；
（2）培养条件可人为改变，并能得到严格的控制，便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响；
（3）体外培养的细胞可以通过各种技术进行观察、分析，实验结果便于观察、检测和记录。

细胞培养虽然具有许多优点，但是也存在一定的局限性，其中最主要的一点是细胞体外培养的体系与真正的机体内环境并不完全一致，细胞的生物学特性在一定程度上也会发生改变，因此，体外培养条件下观察到的结果可能并不绝对地符合机体内细胞的真实情况，这一点在应用培养细胞进行研究时必须充分考虑。

2 体外细胞培养特点与类型
体外培养的细胞主要呈现悬浮型和贴壁型两种状态，并在培养过程中，表现出一些固有的生长特性：接触抑制和密度抑制、自分泌和旁分泌等，此外，对于贴壁型细胞而言，体外生长增殖过程中，存在反复贴壁的现象，充分认识这些培养特点，对于维持细胞的正常形态和生理功能十分重要。

接触抑制是指某些贴壁型细胞在生长过程中因为相互接触而导致一方或双方停止生长的现象，而当细胞密度进一步增大，细胞汇合成片时，培养体系中的营养成分逐步被细胞消耗，细胞代谢产物增多，此时细胞分裂停止，并能维持一段时间的静止状态，这一现象即密度抑制，其细胞密度与培养体系中血清浓度的高低相关。

值得提出的是，转化细胞或恶性肿瘤细胞在培养过程中，因其高分化、增殖能力，通常可以跨越这种限制，而不表现出这些生长特性。

细胞体外培养的另一个重要特性是自分泌与旁分泌。

机体内，细胞分泌物往往通过内分
泌的形式，影响到远处的效应细胞，但是在体外培养体系中，细胞分泌产生的各种因子直接扩散到培养液中，并以细胞自身为中心，形成一个逐步降低的浓度体系，这些细胞因子不仅能够影响到邻近细胞的生长，同时对分泌细胞自身的增殖分裂具有促进作用，因此，细胞培养起始阶段，要求尽可能采用较小的培养体系，增大细胞密度，以实现细胞快速增殖的目的。

反复贴壁是贴壁细胞生长增殖过程中往往被忽视的一个现象。

事实上，这一生长特性对于贴壁细胞的培养至关重要，有时甚至会决定细胞培养方式的选择。

贴壁细胞在分裂增殖时，总是重复进行着分离-分裂-贴壁-再分离-再分裂-再贴壁的循环过程，此时，任何的扰动，对于细胞的贴壁都可能产生比较大的影响，因此，体外培养细胞的时候，应避免过于频繁地移动培养容器，以免影响细胞的正常生长。

3 细胞培养基及常用培养试剂
维持细胞在体外正常的生长、增殖需要为其提供适宜的生长环境，其中培养基是细胞生长所需营养物质的主要来源，而其他各种试剂，包括一些盐平衡溶液、消化液、pH调整液等，对细胞培养体系的维持也必不可少。

3.1细胞培养基
培养基是细胞生长的场所，是提供细胞营养和促进细胞生长的物质基础。

培养基主要包含天然培养基、人工合成培养基以及无血清培养基等。

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。

在细胞技术建立早期，基本上所有的细胞培养都采用该类培养基作为细胞营养物质的来源。

血清富含营养，是最有效、最常用的天然培养基。

依其来源划分，主要有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清以及不常用的马血清、鸡血清、羊血清等，其中，胎牛血清采自剖腹产的胎牛，其受到的外界环境影响最小，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，往往用于培养比较珍贵或难以扩增的细胞。

天然培养基营养丰富，并且更接近体内的真实环境，但是由于天然培养基制作过程复杂、各批次间往往表现出较大差异，同时，天然培养基包含的各种物质也不全然对细胞生长有利，因此，随着对细胞培养条件要求越来越高，天然培养基逐步被各种人工合成培养基所取代。

人工合成培养基最大的优点是化学成分明确、组分相对稳定。

同时由于可以人为控制生产、加工过程，不同批次间的差异可以维持在极低的水平。

人工合成培养基中包含的成分主要有糖类、各种必需氨基酸、维生素、无机盐类等。

自1950年首个合成培养基199问世以来，至今已有几十种合成培养基可供客户选择。

但值得一提的是，由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，同时，由于对天然培养基有利成分的认识尚不完全清楚，合成培养基并不能包含所有细胞所需的营养物质，因此，一般需在合成细胞培养基中添加5～10%的血清，以补充培养体系的营养成分。

血清的加入一方面为细胞提供了更为全面的营养物质，但同时也增加了培养体系成分的复杂性，特别是在应用细胞进行工业生产的过程中，给后续培养产物的分离、纯化和检测带来了极大的不便。

无血清细胞培养基（Serum Free Medium, SFM）是指在使用中无需添加血清的细胞培养基，且其组成不含有任何动物组分。

按照其组分分类，可进一步分为无动物组分无血清细胞培养基（Animal Free SFM）和化学限定无血清细胞培养基（Chemical Defined SFM），前者组分中可能含有某些植物来源成分，而后者完全由化学成分明确的组分组成。

大多数的无血清培养基通常需添加生长附加成分，如激素与生长因子、低分子营养成分和转铁蛋白等促细胞
生长的附加成分，一般包括胰岛素、孕酮、硒酸钠、腐胺、转铁蛋白等。

由于无血清培养基不仅能够有效支持细胞生长，同时也避免了使用血清带来的问题，所以，在生物制药行业中被广泛应用。

目前，已有多种无血清培养基上市，如杂交瘤细胞无血清培养基、CHO细胞无血清培养基、昆虫细胞无血清培养基等。

3.2细胞培养其他常用试剂
细胞培养过程中，除了培养基外，还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH调整液等。

平衡盐溶液简称盐溶液，主要包含无机盐、葡萄糖等组分，兼具缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应等特点。

用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗以及试剂配制等，其主要作用是维持细胞内外渗透压的平衡、保持pH值稳定并能够为细胞的生长提供简单的营养和必需的无机离子。

在进行原代培养时常常需要将组织块消化解离成细胞悬液，继代培养过程中也需要将贴壁细胞从培养容器壁上用消化液消化下来。

目前细胞培养过程中所用的消化液主要有胰酶、EDTA溶液以及胶原酶等。

（i）胰酶是细胞培养过程中使用最多的消化液，通过水解细胞间的蛋白质使细胞离散。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样，并且与胰酶浓度、温度和作用时间有关，在pH 8.0、37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。

因此，在使用胰酶消化细胞时，应控制好浓度、温度和作用时间，以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+、Mg2+和血清可降低胰酶的活性，配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐溶液，而相应的，在终止消化时，可用含有血清的培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

（ii）EDTA是另一种比较常用的细胞消化液，通过破坏细胞间的连接，达到分散细胞的目的。

对于某些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。

（iii）胶原酶在上皮类细胞培养过程中经常用到，顾名思义，其作用对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。

胶原酶活性不受Ca2+、Mg2+以及血清的影响，配制时可用PBS。

培养体系的酸碱度（pH值）对于细胞的正常生长至关重要，一般需维持在pH7.2～7.4之间，对某些细胞而言，可以稍微偏酸，但是最低不能低于6.8，因此，细胞培养基中需要添加pH调整液以维持pH的稳定，目前常用的两种pH调整液有HEPES溶液和NaHCO3溶液。

4 细胞培养耗材与仪器
4.1细胞培养耗材
体外培养细胞是一个多步骤，并要求无菌操作的过程，这些特性决定了在细胞培养阶段所使用的耗材需要具有更高的品质要求。

4.1.1细胞培养瓶、皿、板
小规模细胞培养往往选择细胞培养瓶、皿或者细胞培养板作为细胞培养容器。

针对不同的实验需求和细胞，所选择的细胞培养容器也有所差异。

比较而言，细胞培养瓶成本较高，操作较为费事，但是相比皿和板，细胞培养瓶具有不易污染的特点，因此常用于长时间连续传代、扩增细胞或贵重细胞的培养；相对的，细胞培养皿成本较低，操作较为方便，但比较大的缺点是，大量或长时间培养时容易出现污染，因此，细胞培养皿常被用来短时间培养实验所需的细胞；细胞培养板规格多样，从较小体积的96孔板到4孔板，在一块板上可以同时实现多种细胞培养或者对同一种细胞给以不同的处理，均一性好，孔与孔之间可比性高，因此，在做克隆挑选或者高通量筛选时能够发挥最大的优势。

此外，值得一提的是，在选择合适的细胞培养器皿时，表面处理工艺也是必须考虑的一个重要因素。

贴壁细胞培养往往要求培养器具表面具有更强的细胞结合能力，而对于强调悬浮培养的细胞，超低细胞结合表面是更为理想的选择，此外，特殊处理的细胞培养表面为实现特殊的要求提供便利，如温敏型细胞培养表面，可以通过改变培养温度，实现细胞的解贴附，从而，避免了因为胰酶等消化液在消化过程中所带来的细胞损害，并且能够收获完整的细胞层，日本科学家利用Thermo提供的温敏培养表面，获得完整的内皮细胞培养层，并用于类似活体组织的构建。

4.1.2移液管&电动移液管移液器
细胞培养过程中，往往需要进行较大体积的液体操作，由于操作的简便性，各种规格的移液管几乎成为细胞培养室的必备用品之一。

最早的移液管为玻璃制品，可以高温高压灭菌并反复使用，但是由于玻璃制品的易碎性以及反复灭菌潜在的风险，目前许多细胞培养室已经基本放弃使用玻璃制的移液管，而采用更加方便、安全、准确的一次性塑料制移液管。

与移液管配合使用，实现较大体积液体操作的常用工具是电动移液管移液器。

绝大多数电动移液管移液器采用手动控制吸、排液操作，在排液末端，由于压力过小的原因，往往会有部分液体不能彻底排净，同时由于其吸取液体量并不能预先设定，所以，操作准确性往往较差，因此，移液管更适用于精确度要求不高的大体积液体操作。

4.1.3细胞培养用其他耗材
细胞培养过程中用到的其他耗材主要还有：离心管（1.5、2.0、15、50ml等规格），冻存管（用于细胞冻存，在5.2细胞冻存部分详述）、吸头、滤器（用于培养基以及培养试剂的过滤除菌等）、细胞刮刀（用于收获细胞、避免胰酶等消化液对细胞的损害）等。

不论何种耗材，首要条件是无菌，在选择冻存管等涉及低温操作的耗材时，还得考虑其低温耐受性以及安全性等。

细胞培养、冻存、操作耗材的正确与细胞生长状况的好坏密切相关，因此，在进行细胞培养之前，需要把各种因素尽可能全面考虑，包括：适用性、可操作性以及性价比等。

4.2细胞培养用仪器
体外培养细胞时，需要细胞培养箱、超净工作台或者生物安全柜、离心机等仪器设备提供合适的培养、操作洁净环境。

4.2.1细胞培养箱
CO2细胞培养箱是体外培养细胞的基本设备之一，为细胞的生长提供合适的外部培养环境。

依其加热形式划分，主要有水套式和气套直热式两大类型。

细胞培养箱作为细胞体外培养的场所，首要条件是无菌，同时必须实现对温度、湿度、CO2浓度的较为精确的控制，此外，在某些特殊细胞培养或者实验过程中，还要求对细胞培养箱内的O2、N2浓度进行控制。

除菌&抑菌
为维持细胞培养箱的洁净程度，不同公司、不同类型的细胞培养箱所采用的策略也不一样，但多从抑菌和灭菌两个方面进行综合考虑。

Thermo公司提供的水套式和气套直热式细胞培养箱一直备受客户青睐，占据全球一半以上的市场份额。

其中，水套式培养箱由于其外部水套不能耐受高温影响，所以需要定期通过消毒剂、酒精抹拭的方法达到除菌目的，或者与细胞培养室一起，通过紫外照射的方式除去污染物的生长，此外，腔体内置的HEPA滤器（High Efficiency Particle Air）也能有效过滤除菌，腔体门关闭5分钟后，即可达到空气洁
净度Class100；气套直热式培养箱，在保留HEPA滤器的同时，还可以通过高温湿热/干热灭菌以达到除菌目的。

此外，在一些小的设计方面，也充分体现了抑菌、除菌的理念，譬如，纯铜内胆能够抑制细菌生长，而纳米银离子盒也能有效减少水盘中的各种污染。

温度
温度是影响细胞生长的重要参数之一。

绝大多数细胞在37℃环境下能够良好生长，但也有少数细胞具有不同的最佳培养温度，如某些禽源细胞，最适生长温度为42℃。

细胞培养箱温度的变化往往对细胞的正常生长造成较大影响，总体而言，高温对细胞的影响更大。

水套式培养箱由于其传热介质水的比容大，吸热、散热速度都比较慢，所以，温度变化较小，更适宜电力不足或者电压不稳的地区，这是水套式细胞培养箱依然广受客户欢迎的一个重要原因；气套式培养箱加热速度快，但稳定性和均一性相对而言差一些。

湿度
细胞培养基成分多样，控制各种成分的浓度与维持细胞内外渗透压的平衡关系密切。

体外培养细胞时，由于水分的蒸发，培养基各种组分的浓度随之升高，从而容易引起细胞内外渗透压的不平衡而导致细胞皱缩破裂，因此，控制细胞培养箱腔体的湿度水平显得尤为重要。

目前绝大多数细胞培养箱采用腔体内置水盘的形式，通过水分的自然或加热蒸发，以维持腔体的饱和湿度，而部分高端培养箱，也可通过腔体外加湿系统，先以廷氏灭菌的方式对水灭菌，然后对水进行雾化碰撒操作，实现箱体的快速湿度饱和。

相比于温度的恢复而言，湿度的回复花费时间更长，往往需要数小时不等。

CO2浓度
细胞培养箱之所以称为CO2培养箱，最关键的一个原因是其能够控制腔体内的CO2浓度。

体外培养细胞，需要维持细胞培养基一定的pH值，对绝大多数细胞而言，pH7.2～7.4是相对理想的酸碱度环境。

细胞生长过程中，由于代谢产物CO2释放量的增多，细胞培养基会逐渐变酸，因此，细胞培养基中往往需要添加NaHCO3缓冲液以调节体系的pH值。

腔体中维持一定的CO2浓度，可以抑制NaHCO3向外释放CO2的倾向，从而维持其合适的缓冲能力。

培养箱中CO2浓度应与细胞培养基中NaHCO3浓度保持一定的平衡，通常情况下，细胞培养箱中CO2浓度控制在5%左右，此时，培养液中NaHCO3的加入量应为1.97 g/L；如果CO2浓度维持在10%，则NaHCO3的加入量应为3.95 g/L。

综上所述，细胞培养箱作为细胞体外生长的场所，不仅需要为其提供一个无菌干净的环境，同时在温度，湿度以及CO2浓度上都需要进行严格的控制，唯有如此，才可能实现细胞的正常生长。

4.2.2超净工作台&生物安全柜
超净工作台或者生物安全柜为细胞传代培养等操作提供场所，二者都能够维持操作区间的洁净程度，实现保护细胞的目的，但超净工作台只能对操作区间的物品进行保护，而生物安全柜则同时保护操作者以及外部环境，因此，在培养对操作者以及环境具有潜在威胁的细胞时，则需要考虑配置生物安全柜。

超净工作台是国内多数细胞培养实验室配置的洁净设备，其基本原理是通过双层过滤装置实现对空气的过滤除菌，并将此洁净空气以一定的速率匀速通过操作区，从而形成无菌无尘的高度洁净操作环境。

根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。

良好的超净工作台是保证细胞培养过程中无污染的关键设备，
特别在环境较差或者不具备无菌操作间的细胞实验室，尤为重要。

4.2.3细胞培养用其他仪器
细胞培养过程中，除培养箱、超净工作台等较专用仪器外，还需要用到离心机、水浴锅、冰箱，显微镜等其他常规实验室设备。

离心机是离心、收集细胞的常用仪器；水浴锅主要用于细胞复苏以及某些情况下血清的灭活；常规实验室冰箱用于各种细胞培养试剂的保存；显微镜对于细胞生长状态的观察必不可少。

值得一提的是，由于过高的离心力对细胞损伤较大，并且不同类型的细胞所能耐受的最大离心力不一样，因此，在离心过程中需要根据细胞类型调整离心速度和时间，一般而言，控制离心力在200～400g之间，即可实现绝大多数细胞的离心、收集并维持其较好的细胞活性。

5 细胞培养基本技术
细胞培养是一种程序复杂并且要求十分严谨的实验技术，要获得理想的培养结果，除对相关耗材以及仪器具有特定的要求外，对操作者也具有较高的要求。

5.1无菌操作与污染检测
无菌操作是细胞培养过程中最基本、但也是最重要的要求之一。

任一步骤、任一培养相关的试剂、耗材、甚至仪器受到污染，对整个培养工作都可能造成严重影响。

绝大多数受污染的细胞，都需抛弃，并需对培养环境进行彻底的消毒。

细胞培养过程中的污染依其污染成分，可以分为化学污染和生物污染两大类，其中化学污染主要出现在细胞培养基以及其他各种细胞培养用试剂中。

细菌内毒素是化学污染中比较常见的一种，它是革兰氏阴性细菌死亡后解体释放出的疏水性细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。

细菌内毒素可刺激部分细胞产生激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。

因此，与细胞培养相关的耗材通常要求无内毒素。

细菌内毒素是临床上最主要的热原（即注射到动物体内会导致动物发热），通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更需避免细菌内毒素的污染。

生物污染包括比较容易发现的细菌、霉菌和酵母污染、较难发现的病毒、支原体污染以及细胞间的交叉污染等。

对于较易发现的生物污染，往往可以通过及时采取措施而减少其影响范围，但对于诸如支原体等很难及时发现的污染，由于冻存方式以及不同实验室间细胞交流的原因，往往出现一种细胞受污染，全实验室所有细胞甚至多个实验室细胞受污染的情况。

细菌、霉菌和酵母广泛存在，特别是在潮湿温暖的地方，更是随处可见，由于它们通常所以，一旦发现霉菌污染，通常需要抛弃整个培养箱中的所有细胞，并对整个培养环境，包括细胞培养箱以及外部无菌室，进行彻底灭菌处理。

病毒颗粒特别微小，并常潜伏于细胞内，对整个细胞培养并不具致死效应，该类型污染一般很难发现，但是由于其具有较高的种属特异性，因此，细胞培养中受病毒污染的几率相对较小。

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5μm之间，形态多样，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。

与细胞、病毒不同，支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色则为阴性。

支原体污染是细胞培养过程中的一个世界性难题，据统计，细胞培养过程中支原体感染的几率高达63%。

由于支原体在细胞培养液中
几乎是透明的，并且对细胞培养过程常中的青链双抗霉素不敏感，不使培养液浑浊，也不引起pH变化，因此，除非使用特殊的检测方法，支原体污染在细胞培养过程中很难被发现，这是造成支原体污染泛滥的主要原因，甚至世界上许多知名细胞库提供的细胞也存在较严重的支原体污染。

交叉污染是另一类较为常见的污染现象，其严重程度远远超过人们的想象。

1981 年对美国ATCC细胞库的调查显示，超过60 种标记为其他细胞株的细胞居然都是HeLa 细胞。

细胞间的交叉污染可分为种间、种内污染两大类。

避免交叉污染，除严格遵循操作规范，减少同时操作的细胞种类外，较关键的一点是在源头上杜绝不同类型细胞的交叉。

在从生物体分离获得原代细胞时，务必小心操作，以获得纯度较高的细胞，从其他实验室或者专业细胞库获得种子细胞时，也应进行严格检测，以尽可能确保无污染。

5.2 细胞冻存与复苏
为了降低细胞体外培养受污染的风险，减少因长期传代培养所致的遗传信息改变，或者因为寄赠、交换和购买等需求，通常需要对培养的细胞进行低温冷冻保存。

目前最有效、也最常用的冻存方式是采用-196℃液氮低温冻存，在这个温度条件下，细胞内的各种生命活动已经基本停止，可以实现细胞的长期保存，并维持其较好的细胞活性。

低温冻存对细胞造成的伤害主要来源于冰晶损伤和溶液渗透压损伤两个方面。

随着温度的下降，细胞内外的水份结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞壁破坏，从而导致细胞死亡，这种因细胞内部结冰而引起的损伤即冰晶损伤。

冰晶损伤往往与冷却速度过快有关，冷却速度越快，冰晶损伤越大。

同时，随着温度的下降，细胞外部的水份会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞外的脂质会因长时间暴露在高溶质的溶液中而损坏，细胞发生脱水渗漏，导致在复苏时大量水份渗入细胞内造成细胞死亡。

这种因保存溶液溶质浓度增高而形成的细胞损伤被称为溶液损伤。

溶液损伤是因为冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成的，冷却速度越慢，此损伤越严重。

细胞冻存与复苏一般遵循“慢冻快复”的基本原则。

冻存前，如果条件允许，可针对细胞状态以及难以观察的污染源进行系统检测，以确保冻存细胞的品质。

许多实验室常采用多步骤冷却的方式进行细胞冻存：首先离心收集状态良好的细胞，重悬于适量的冻存液中，并分装到合适的冻存管中，然后依次按照4℃ 30分钟、-20℃ 1～2小时、-80℃过夜并最终移至液氮长期保存的方式进行冻存。

这种方式能够满足多数细胞冻存的要求，但由于其操作相对繁琐，并且对细胞活性存在一定损伤，因此，目前越来越多的实验室倾向于使用梯度降温盒或者更高端的程序降温仪，以达到精确控制降温速率，降低损伤的目的。

减少细胞损伤的另一种策略是选用合适的冻存液，并添加冷冻保护剂。

冷冻保护剂根据其是否能够穿透细胞膜可以分为渗透性和非渗透性两大类别。

目前细胞冻存过程中使用最多的DMSO 和甘油都属于渗透性冷冻保护剂，其作用机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水份也不会过度外渗，避免了细胞过度脱水皱缩。

DMSO对细胞的渗透较快，对细胞的保护效果较好，常用工作浓度为5～15%（V/V），但DMSO本身具有较大的细胞毒性作用，在4℃时伤害尤甚，因此，应用添加DMSO的冻存液冻存细胞时，不建议在此温度下长时间放置，通常与程序降温仪或梯度降温盒配合使用实现温度连续匀速降低。

甘油是另一种较常用的冷冻保护剂，工作浓度常为5～20%（V/V），对细胞的毒性作用较小，但对细胞渗透压影响较大，特别是在细胞复苏时尤为明显。

为减少甘油对细胞的影响，复苏时，可通过逐步稀释的方法去除冻存液中的甘油。

高浓度血清也可减少低温冻存对细胞的损伤，血清浓度越。