PITC柱前衍生HPLC氨基酸比值测定

PITC柱前衍生高效液相法测定缩宫素氨基酸比值

一．前言

目前，氨基酸检测主要应用氨基酸自动分析仪和HPLC。随着HPLC的发展，使用HPLC技术分析氨基酸获得迅速发展。HPLC已成为一种较为理想的检测氨基酸的方法。HPLC检测氨基酸时，使用不同衍生剂反应后产生不同的衍生物，不同的衍生物所需色谱条件也有差别。查阅相关的研究报告，所使用的衍生剂及色谱条件也不尽相同。每种方法各有自己的优缺点，应根据所测样品的特性和仪器、试剂条件作出选择，最后选择异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法测定缩宫素氨基酸比值。

二．准备工作

主要设备和试剂

1.氨基酸分析专用柱（4.6×250，5um）1支 Agela公司

2.高效液相检测仪 1台安捷伦

3.十八种氨基酸 1套中检所

4.异硫氰酸苯酯 10瓶 Agela公司

5.三乙胺 2瓶 Agela公司

试剂配制

1.三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1瓶，加乙腈8.6ml，混匀。

2.异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2ml，混匀。 4℃ 3天

3.流动相A：称取三水醋酸钠25.3g（或无水醋酸钠15.2g），加水1400ml，用冰醋酸调节

pH6.5，用水使成1860ml，再加乙腈140ml，使成2000ml，0.45um醋酸纤维膜过滤。

4.流动相B：80%乙腈，0.45um有机膜过滤。

5.氨基酸标准贮备液

中检所十八种氨基酸，105℃3小时。使用十万分子一天平。

半胱氨酸是以胱氨酸折算成两份半胱氨酸进行计算。用0.1mol/L盐酸溶解至250ml。

衍生方法

取标准品（样品）0.2ml，加100mmol/L异硫氰酸苯酯乙睛溶液0.1ml，加1mol/L三乙胺乙睛溶液0.1ml，混匀，室温放置1小时，加入0.4ml正己烷，振摇，放置10分钟，取下层清液过滤后进样。

三．实验部分

1.色谱条件选择

1.1精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。用以下3个方法进行检测。从而确定最佳洗脱条件。

方法1

流速：1ml/min

检测波长：254nm

柱温：40℃

进样体积：2ul

洗脱梯度：

方法2

流速：1ml/min

检测波长：254nm

柱温：40℃

进样体积：2ul

洗脱梯度：

方法3

流速：1ml/min

检测波长：254nm

柱温：40℃

进样体积：2ul

洗脱梯度：

1.2根据实验结果，确定最佳洗脱条件后，更改进样量为1ul。从而确定进样量的改变是否影响检测。

1.3在WS-10001-（HD-0903）-2002规定用0.02mol/L盐酸溶液，但是考虑到某些氨基酸在0.02mol/L盐酸中不溶，所以改成0.1 mol/L盐酸溶液。为考察pH是否有影响，所以根据先前实验结果，确定最佳洗脱条件后，进行以下实验。

①精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。

②精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加2ml0.1mol/L盐酸溶液后加水至刻度。

③精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加水至刻度。

1.4 WS-10001-（HD-0903）-2002中规定使用外标法，但由于氨基酸分析过程比较复杂，影响因素较多，而且取样量比较少。查阅欧美药典，发现氨基酸分析中采用内标法以减少分析误差。

内标溶液1：称取α—氨基丁酸10mg，加水溶解至250ml。

内标溶液2：称取正亮氨酸10mg，加0.1mol/L盐酸溶解至100ml。

①精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加5ml内标溶液1，再加5ml内标溶液2，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（100pmol/L）进样一针。

②精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加5ml内标溶液1，再加5ml内标溶液2，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L）进样一针。

2.检测方法学验证

通过色谱条件选择后，能确定最佳的检测条件，然后进行以下检测方法学验证。

2.1线性

内标溶液：称取α—氨基丁酸10mg，加水溶解至100ml。

①精密量取1ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加1ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（50pmol/L）

②精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加2ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（100pmol/L）

③精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加4ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L）

④精密量取6ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加6ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（300pmol/L）

⑤精密量取8ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加8ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（400pmol/L）

2.2重现性

精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加4ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L）（分别衍生6次）

2.3稳定性

精密量取4ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加4ml内标溶液，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度。（200pmol/L）

分别于0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、24小时进样。

四．结果汇总

1.1色谱条件选择

①根据实验情况和液相图谱，方法3的梯度洗脱简单，基线相对平稳。

②进样量的改变会影响氨基酸的峰形，进样量改为1ul时，不易产生拖尾等现象。

③稀释氨基酸标准贮备液的溶剂改变（即改变标准品溶液pH），不会影响标准品的出峰时间和峰形。

④α—氨基丁酸为内标，该内标物的衍生物位于脯氨酸衍生物和酪氨酸之间，分离度较大。但是，正亮氨酸的衍生物位于亮氨酸衍生物之后，易与亮氨酸重合。

1.2线性

根据实验情况，各氨基酸的R2如下：

1.3重现性（RSD）