遗传学课件12第十二章(遗传工程)
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两种DNA连接酶都不能催化单链DNA之间的连 接反应，被连接的DNA链必须是双链DNA分子 的一部分。
T4 DNA连接酶还可以催化二个具有平齐末端 的双链DNA片段之间的连接反应，而大肠杆菌 连接酶一般不具有这种活性。
（三）反转录酶
• 反转录酶（reverse transcriptase）是 一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚 合酶，所以又称为依赖于RNA的DNA聚合 酶。
图12-6 重组质粒的蓝白斑筛选
2、病毒载体
λ噬菌体载体
可以接受 15~23kb的外 源DNA片段
图12-10 利用噬菌体为载体克隆外 源DNA的策略
3、克隆大片段DNA的载体
黏粒载体、细菌人工染色体和酵 母人工染色体载体 。
黏粒载体（cosmid）柯斯 质粒
可以接受15~45kb的外源 DNA
重组DNA的步骤
（1）从细胞或组织获得DNA并纯化； （2）用限制酶切割DNA；
（3）将获得的限制片段连接到载体上。 （4）重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内
重组DNA分子复制，产生大量相同拷贝的 重组DNA分子，称为克隆； （5）克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收， 纯化； （6）克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可 以被分离出来用于研究或商业开发。
变性温度：93-94 ℃， 30-60秒
退火温度：36-60 ℃, 30-60秒
延伸温度：72 ℃,
1.5-2分
循环30-40次;
最后72 ℃补齐10分钟。
表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系
循环数 1 5 10 15 20 25 30
PCR产物拷贝数
21
2
25
32
210
1024
产生纯合后代
克隆T-DNA两侧的植物DNA（Plasmid rescue; IPCR; Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证
（三）PCR扩增基因
（四）人工合成基因
第三节 外源基因的导入
一、重组DNA导入原核生物
1．CaCl2处理转化：
将细菌细胞用冰上预冷的CaCl2处理，然后 转移到42℃的条件下处理90秒。CaCl2处 理转化的机制尚不清楚，可能是CaCl2处 理破坏了细菌的细胞壁，使游离的DNA分 子被摄入受体细胞。转化频率大概是千分 之一。
甲基化
胞嘧啶
5—甲基胞嘧啶
三种限制性内切酶
Ⅰ型限制性内切酶： 酶切部位没有特异性，随机切割双链DNA分子。 EcoB和EcoK
Ⅱ型限制性内切酶： 酶切部位有特异性，能识别DNA分子上特 定的DNA序列。
Ⅲ型限制性内切核酸酶（Ⅲ型酶） 具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的。
Ⅱ型酶有几个基本特性
冠瘿碱代谢 酶编码பைடு நூலகம்因
Ti 质粒 复制起 始点
各种不同类型的Ti质粒都具有T-DNA区、毒性 区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿 碱分解位点(图12-13)。其中以T-DNA区和毒性 区在植物转化中最为重要。
T-D N A 区 细 胞 分 裂 素 合 成 基 因
生长素合成基因
冠瘿碱合成基因
左边界
α受体片段：酶的C端片段，一般存在于宿 主细胞。
α供体片段：酶的N端片段，一般存在于 质粒载体。
α供体片段+α受体片段
有活性
质粒载体含有 LacZ基因的N端编码序列， 在编码区含有多克隆位点，不影响酶的 活性，选择含有β-半乳糖苷酶C端片段 的宿主细胞。
在含有X-gal（5-溴-4-氢-3-吲哚- β –D-半乳糖苷）的培养基中形成兰色菌落， 但如果外源DNA插入到多克隆位点，将绝 对地产生不具有α互补功能的N端片段产 生，菌斑为白色。
（4） 分子量小，多拷贝，易于操作。
1、质粒载体
质粒：细菌细胞内 独立于细菌染色 体而自然存在的、 能自我复制、易 分离和导入的环 状双链DNA分子。
外源DNA片段小于10kb
图12-8 质粒PUC18的结构及多 克隆位点
α互补：
α互补是指大肠杆菌β-半乳糖苷酶的两 个无活性片段组合成为功能完整的酶的过 程。
反转录酶在遗传工程中的主要用途是 以mRNA为模板合成cDNA 。
cDNA文库代表的 是某一特定细胞， 或组织，或某一发 育阶段的表达的基 因，而基因组文库 代表的是基因组中 所有的基因。
（四）聚合酶链式反应
• 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）
• PCR反应在一种混合液中进行（PCR mixture）包括四种主要成分：两个引物 （一般为20 bp）；模板DNA；热稳定的 DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸。
① 在DNA分子上有特异识别和切割的序列部位， 使被切割的DNA分子形成单链的断裂；
② DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接 相对的；
③ 断裂结果所形成的DNA片段常具有碱基互补的 单链尾巴（粘性末端），使其能够重新连接；
④ 内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催 化所完成，即该类内切酶活性和甲基化作用活 性是分开的，只需要Mg2+来激活，不需要ATP辅 助因子。
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）染 色体外的遗传物 质，为双股共价 闭合的环状DNA 分子，约有 150~200kb。
T-D N A 区 细 胞 分 裂 素 合 成 基 因
生长素合成基因
冠瘿碱合成基因
左边界
右边界
致毒区
与 Ti 质 粒转 移功能 有关的遗传座位
图12-5 重组DNA技术流程
（二）载体(vector)
作为载体DNA分子，必须储备的4个条件：
（1）具有复制原点，在宿主细胞中不仅能独立地自我 复制，而且能带动携带的外源基因一起复制。
（2）具有多克隆位点，即具有多种限制性酶切位点， 且每一种酶的切点只有一个。
（3）至少具有一个选择标记基因。如抗菌素的抗性基 因或某种酶的基因。
Vir区段上的基因与T-DNA 从细菌转移到植物细胞的遗 传过程有关，区段上的基因 能够使农杆菌表现出毒性， 故称之为毒性区。
T-D N A 区 细 胞 分 裂 素 合 成 基 因
1、基因库的构建
基因组文库：全部基因组DNA酶切后与载体 连接构建而成的一个重组DNA群体 。
cDNA文库：是以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，
合成互补DNA（cDNA），将获得的双链cDNA与适当载体 连接并转化到宿主细胞内进行扩增，而构建成的基因库。
cDNA文库与基因组文库的不同
基因组文库代表了基因组中的所有基因，而 cDNA文库仅代表某一特定细胞类型，某一 组织，或某一胚胎发育时期的表达序列。
遗传学课件12第十二章（遗传工程）
第一节 基因工程概述
生物工程（biological engineering） 是指利用工程技术的方法改造和修饰生 物体，使其产生新的性状或产品，从而 改良生物体的一种遗传学手段。
广义生物工程：细胞工程、基因工程、酶工 程、发酵工程 狭义生物工程：基因工程
基因工程
2．电激转化（electroporation） 是目前常用的一种转化方式。在电转化仪施加的
强电场的作用下，使受体细胞细胞壁具有可逆 的电穿孔，以使DNA分子进入细胞。进行电转 化操作时，细菌细胞和DNA分子放在带有电极 的小室中，通过小室（chamber）施加电脉冲， 使细胞壁穿孔，然后DNA分子进入细胞。电转 化的频率通常是10-6~10-9，因质粒的大小而异。
(2) 筛选文库
（3）阳性克隆的分析与鉴定
从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行 测序才能进行生物信息分析和功能预 测。，确定测定的核酸序列是不是所需 要的基因，采用适当的软件预测它具有 什么功能。
（二）T-DNA标签克隆基因
T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子
筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体
• 聚合酶是Taq酶（AmpliTaq polymerase，
在95℃甚至更高的温度下活性稳定）。
• PCR反应已经自动化，在PCR仪（thermocycler） 上进行。
• 基本过程：
通过高温，双链DNA变成单链DNA——变性；
通过降低温度，使引物和摸板配对——退火;
利用耐热DNA聚合酶,合成产物DNA——延伸。
3．结合（conjugation）结合是原核生物细 胞与细胞接触而进行遗传物质转移的一 种自然过程。
二、植物表达载体
作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能： （1）能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中
去，并且整合到宿主细胞的基因组DNA上； （2）能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识
别的DNA序列，即启动子和复制子起始位点， 以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复 制和表达。
定义：利用人工的方法把生物的遗传物质 在体外进行切割、拼接和重组，获得重 组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体， 使受体的遗传特性得到修饰或改变的过 程。
基因工程的特点
1、跨越天然物种屏障，实现动物、植物、 微生物间的遗传物质交换。
2、只定向改变一个或少数几个性状，而不 改变品种的其他特性。
3、可以人为控制基因的表达。
2．从基因库中分离特定的克隆序 列(基因)
（1） DNA探针
探针是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核 酸序列。利用DNA探针可以从基因库中筛选特 定的克隆
通常探针用同位素标记，但也可使用荧光标记或 颜色反应标记探针。探针可以有多种来源， 如果筛选植物基因，探针可以来源于植物本 身，也可以来源于异源植物、动物中的同类 基因的保守序列。
基本技术流程： 目的基因克隆
植物表达载体的构建 转化植物细胞
筛选抗生素抗性细胞
再生抗性植株
整合——PCR, Southern杂交, 原位杂交 转录——RT-PCR, 定量PCR, Northern杂交 翻译——Western杂交
生物检测 遗传分析
第二节 基因的分离
基因克隆通常包括三个步骤：
1）目标DNA片段（基因）的分离； 2）目标基因克隆到载体上； 3）载体导入宿主细胞并在其中大量复制。
215
32768
220
1048576
225
33554432
230
1073741824
图12-6 在紫外灯下观察到的琼脂糖凝胶电泳后的 DNA条带
二、载体(vector)
（一）重组DNA技术
重组DNA（recombinant DNA）主要指利用不同生 物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子，是自 然界中不存在的DNA分子。
质粒的复 制原点
噬菌体DNA包装成 功噬菌体时所必需 的。
图12-11黏粒载体pJB8图谱
细菌人工染色体（BAC）
可以克隆 300kb左右 片段
酵母人工染色体（YAC）
• YAC载体可以 插入大片段的 DNA（1-2Mb）
三、基因的分离
（一）从基因文库中分离基因 基因文库：是由单一来源的特定组织或器官的DNA 或cDNA片段汇总形成的克隆群体。
表12-1 不同限 制酶的识别、 切割和修饰位 点
回纹对称序列 echo-r-one
（二）DNA连接酶
能催化DNA中相邻的 3’ –OH和5’ – 磷酸基 末端之间形成磷酸二酯 键并把两段DNA连接起 来。
在分子克隆中使用的DNA连接酶有两种。 即大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶。
一、工具酶
（一）限制性核酸内切酶（限制性酶） （restriction enzyme）
在识别双链DNA分子中某些特定核苷酸序列 的基础，切割DNA双链的内切酶。
限制修饰系统：
细菌细胞具有防御异源遗传物质（病毒）的进 入的能力，异源DNA分子进入后，会被限制酶 识别并降解，这个过程称为限制。
细菌（宿主）本身的DNA通过甲基化酶的作用， 使DNA得到修饰，免遭自身限制性内切酶的破 坏。
右边界
T-DNA(转移DNA): 是农杆菌侵 染植物细胞时，从Ti质粒上导 致 毒 区 入植物细胞的一段DNA。
与 Ti 质 粒转 移功能 有关的遗传座位
冠瘿碱代谢 酶编码基因
Ti 质粒 复制起 始点
T-DNA两端各有一段25bp的重复序列（分别称为左边界 序列和右边界序列）。
T-DNA携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有关的 基因，称为致瘤基因，T-DNA的右端序列对T-DNA转移 到植物细胞内具有重要意义。保留T-DNA两端的末端序 列，然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA 的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去，从而导致 转化的植物细胞不具有成瘤能力。
T4 DNA连接酶还可以催化二个具有平齐末端 的双链DNA片段之间的连接反应，而大肠杆菌 连接酶一般不具有这种活性。
（三）反转录酶
• 反转录酶（reverse transcriptase）是 一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚 合酶，所以又称为依赖于RNA的DNA聚合 酶。
图12-6 重组质粒的蓝白斑筛选
2、病毒载体
λ噬菌体载体
可以接受 15~23kb的外 源DNA片段
图12-10 利用噬菌体为载体克隆外 源DNA的策略
3、克隆大片段DNA的载体
黏粒载体、细菌人工染色体和酵 母人工染色体载体 。
黏粒载体（cosmid）柯斯 质粒
可以接受15~45kb的外源 DNA
重组DNA的步骤
（1）从细胞或组织获得DNA并纯化； （2）用限制酶切割DNA；
（3）将获得的限制片段连接到载体上。 （4）重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内
重组DNA分子复制，产生大量相同拷贝的 重组DNA分子，称为克隆； （5）克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收， 纯化； （6）克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可 以被分离出来用于研究或商业开发。
变性温度：93-94 ℃， 30-60秒
退火温度：36-60 ℃, 30-60秒
延伸温度：72 ℃,
1.5-2分
循环30-40次;
最后72 ℃补齐10分钟。
表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系
循环数 1 5 10 15 20 25 30
PCR产物拷贝数
21
2
25
32
210
1024
产生纯合后代
克隆T-DNA两侧的植物DNA（Plasmid rescue; IPCR; Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证
（三）PCR扩增基因
（四）人工合成基因
第三节 外源基因的导入
一、重组DNA导入原核生物
1．CaCl2处理转化：
将细菌细胞用冰上预冷的CaCl2处理，然后 转移到42℃的条件下处理90秒。CaCl2处 理转化的机制尚不清楚，可能是CaCl2处 理破坏了细菌的细胞壁，使游离的DNA分 子被摄入受体细胞。转化频率大概是千分 之一。
甲基化
胞嘧啶
5—甲基胞嘧啶
三种限制性内切酶
Ⅰ型限制性内切酶： 酶切部位没有特异性，随机切割双链DNA分子。 EcoB和EcoK
Ⅱ型限制性内切酶： 酶切部位有特异性，能识别DNA分子上特 定的DNA序列。
Ⅲ型限制性内切核酸酶（Ⅲ型酶） 具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的。
Ⅱ型酶有几个基本特性
冠瘿碱代谢 酶编码பைடு நூலகம்因
Ti 质粒 复制起 始点
各种不同类型的Ti质粒都具有T-DNA区、毒性 区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿 碱分解位点(图12-13)。其中以T-DNA区和毒性 区在植物转化中最为重要。
T-D N A 区 细 胞 分 裂 素 合 成 基 因
生长素合成基因
冠瘿碱合成基因
左边界
α受体片段：酶的C端片段，一般存在于宿 主细胞。
α供体片段：酶的N端片段，一般存在于 质粒载体。
α供体片段+α受体片段
有活性
质粒载体含有 LacZ基因的N端编码序列， 在编码区含有多克隆位点，不影响酶的 活性，选择含有β-半乳糖苷酶C端片段 的宿主细胞。
在含有X-gal（5-溴-4-氢-3-吲哚- β –D-半乳糖苷）的培养基中形成兰色菌落， 但如果外源DNA插入到多克隆位点，将绝 对地产生不具有α互补功能的N端片段产 生，菌斑为白色。
（4） 分子量小，多拷贝，易于操作。
1、质粒载体
质粒：细菌细胞内 独立于细菌染色 体而自然存在的、 能自我复制、易 分离和导入的环 状双链DNA分子。
外源DNA片段小于10kb
图12-8 质粒PUC18的结构及多 克隆位点
α互补：
α互补是指大肠杆菌β-半乳糖苷酶的两 个无活性片段组合成为功能完整的酶的过 程。
反转录酶在遗传工程中的主要用途是 以mRNA为模板合成cDNA 。
cDNA文库代表的 是某一特定细胞， 或组织，或某一发 育阶段的表达的基 因，而基因组文库 代表的是基因组中 所有的基因。
（四）聚合酶链式反应
• 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）
• PCR反应在一种混合液中进行（PCR mixture）包括四种主要成分：两个引物 （一般为20 bp）；模板DNA；热稳定的 DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸。
① 在DNA分子上有特异识别和切割的序列部位， 使被切割的DNA分子形成单链的断裂；
② DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接 相对的；
③ 断裂结果所形成的DNA片段常具有碱基互补的 单链尾巴（粘性末端），使其能够重新连接；
④ 内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催 化所完成，即该类内切酶活性和甲基化作用活 性是分开的，只需要Mg2+来激活，不需要ATP辅 助因子。
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）染 色体外的遗传物 质，为双股共价 闭合的环状DNA 分子，约有 150~200kb。
T-D N A 区 细 胞 分 裂 素 合 成 基 因
生长素合成基因
冠瘿碱合成基因
左边界
右边界
致毒区
与 Ti 质 粒转 移功能 有关的遗传座位
图12-5 重组DNA技术流程
（二）载体(vector)
作为载体DNA分子，必须储备的4个条件：
（1）具有复制原点，在宿主细胞中不仅能独立地自我 复制，而且能带动携带的外源基因一起复制。
（2）具有多克隆位点，即具有多种限制性酶切位点， 且每一种酶的切点只有一个。
（3）至少具有一个选择标记基因。如抗菌素的抗性基 因或某种酶的基因。
Vir区段上的基因与T-DNA 从细菌转移到植物细胞的遗 传过程有关，区段上的基因 能够使农杆菌表现出毒性， 故称之为毒性区。
T-D N A 区 细 胞 分 裂 素 合 成 基 因
1、基因库的构建
基因组文库：全部基因组DNA酶切后与载体 连接构建而成的一个重组DNA群体 。
cDNA文库：是以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，
合成互补DNA（cDNA），将获得的双链cDNA与适当载体 连接并转化到宿主细胞内进行扩增，而构建成的基因库。
cDNA文库与基因组文库的不同
基因组文库代表了基因组中的所有基因，而 cDNA文库仅代表某一特定细胞类型，某一 组织，或某一胚胎发育时期的表达序列。
遗传学课件12第十二章（遗传工程）
第一节 基因工程概述
生物工程（biological engineering） 是指利用工程技术的方法改造和修饰生 物体，使其产生新的性状或产品，从而 改良生物体的一种遗传学手段。
广义生物工程：细胞工程、基因工程、酶工 程、发酵工程 狭义生物工程：基因工程
基因工程
2．电激转化（electroporation） 是目前常用的一种转化方式。在电转化仪施加的
强电场的作用下，使受体细胞细胞壁具有可逆 的电穿孔，以使DNA分子进入细胞。进行电转 化操作时，细菌细胞和DNA分子放在带有电极 的小室中，通过小室（chamber）施加电脉冲， 使细胞壁穿孔，然后DNA分子进入细胞。电转 化的频率通常是10-6~10-9，因质粒的大小而异。
(2) 筛选文库
（3）阳性克隆的分析与鉴定
从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行 测序才能进行生物信息分析和功能预 测。，确定测定的核酸序列是不是所需 要的基因，采用适当的软件预测它具有 什么功能。
（二）T-DNA标签克隆基因
T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子
筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体
• 聚合酶是Taq酶（AmpliTaq polymerase，
在95℃甚至更高的温度下活性稳定）。
• PCR反应已经自动化，在PCR仪（thermocycler） 上进行。
• 基本过程：
通过高温，双链DNA变成单链DNA——变性；
通过降低温度，使引物和摸板配对——退火;
利用耐热DNA聚合酶,合成产物DNA——延伸。
3．结合（conjugation）结合是原核生物细 胞与细胞接触而进行遗传物质转移的一 种自然过程。
二、植物表达载体
作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能： （1）能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中
去，并且整合到宿主细胞的基因组DNA上； （2）能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识
别的DNA序列，即启动子和复制子起始位点， 以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复 制和表达。
定义：利用人工的方法把生物的遗传物质 在体外进行切割、拼接和重组，获得重 组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体， 使受体的遗传特性得到修饰或改变的过 程。
基因工程的特点
1、跨越天然物种屏障，实现动物、植物、 微生物间的遗传物质交换。
2、只定向改变一个或少数几个性状，而不 改变品种的其他特性。
3、可以人为控制基因的表达。
2．从基因库中分离特定的克隆序 列(基因)
（1） DNA探针
探针是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核 酸序列。利用DNA探针可以从基因库中筛选特 定的克隆
通常探针用同位素标记，但也可使用荧光标记或 颜色反应标记探针。探针可以有多种来源， 如果筛选植物基因，探针可以来源于植物本 身，也可以来源于异源植物、动物中的同类 基因的保守序列。
基本技术流程： 目的基因克隆
植物表达载体的构建 转化植物细胞
筛选抗生素抗性细胞
再生抗性植株
整合——PCR, Southern杂交, 原位杂交 转录——RT-PCR, 定量PCR, Northern杂交 翻译——Western杂交
生物检测 遗传分析
第二节 基因的分离
基因克隆通常包括三个步骤：
1）目标DNA片段（基因）的分离； 2）目标基因克隆到载体上； 3）载体导入宿主细胞并在其中大量复制。
215
32768
220
1048576
225
33554432
230
1073741824
图12-6 在紫外灯下观察到的琼脂糖凝胶电泳后的 DNA条带
二、载体(vector)
（一）重组DNA技术
重组DNA（recombinant DNA）主要指利用不同生 物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子，是自 然界中不存在的DNA分子。
质粒的复 制原点
噬菌体DNA包装成 功噬菌体时所必需 的。
图12-11黏粒载体pJB8图谱
细菌人工染色体（BAC）
可以克隆 300kb左右 片段
酵母人工染色体（YAC）
• YAC载体可以 插入大片段的 DNA（1-2Mb）
三、基因的分离
（一）从基因文库中分离基因 基因文库：是由单一来源的特定组织或器官的DNA 或cDNA片段汇总形成的克隆群体。
表12-1 不同限 制酶的识别、 切割和修饰位 点
回纹对称序列 echo-r-one
（二）DNA连接酶
能催化DNA中相邻的 3’ –OH和5’ – 磷酸基 末端之间形成磷酸二酯 键并把两段DNA连接起 来。
在分子克隆中使用的DNA连接酶有两种。 即大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶。
一、工具酶
（一）限制性核酸内切酶（限制性酶） （restriction enzyme）
在识别双链DNA分子中某些特定核苷酸序列 的基础，切割DNA双链的内切酶。
限制修饰系统：
细菌细胞具有防御异源遗传物质（病毒）的进 入的能力，异源DNA分子进入后，会被限制酶 识别并降解，这个过程称为限制。
细菌（宿主）本身的DNA通过甲基化酶的作用， 使DNA得到修饰，免遭自身限制性内切酶的破 坏。
右边界
T-DNA(转移DNA): 是农杆菌侵 染植物细胞时，从Ti质粒上导 致 毒 区 入植物细胞的一段DNA。
与 Ti 质 粒转 移功能 有关的遗传座位
冠瘿碱代谢 酶编码基因
Ti 质粒 复制起 始点
T-DNA两端各有一段25bp的重复序列（分别称为左边界 序列和右边界序列）。
T-DNA携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有关的 基因，称为致瘤基因，T-DNA的右端序列对T-DNA转移 到植物细胞内具有重要意义。保留T-DNA两端的末端序 列，然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA 的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去，从而导致 转化的植物细胞不具有成瘤能力。