菌种选育方法

培养
滤
凝胶
免疫
纸
分析
NC 膜
＋
转膜2020/3/31
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工程菌的稳定性问题
• 由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰 素、人生长激素、乙肝表面抗原、人促红细 胞生成素(EPO)、重组激酶、集落刺激因子 GM-CSF等，成本大大下降
• 研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生 20产20/3/过31 程中表现出不稳定性，因而工程菌稳定39
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主要内容
• 菌种选育 – 自然选育 – 诱变育种 – 抗噬菌体菌株的选育 – 杂交育种 – 原生质体融合技术 – DNA重组技术 – 菌种保藏
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2.2.6 DNA重组技术
概述
基因工程（genetic engineering） ：在生物
体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和
防止或降低工程菌的不稳定性
• (1)组建合适载体 在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段
或基因以使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。
• (2)选择适当宿主 重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细
胞遗传特性的影响，住选择宿主时，必须确定其遗传特点。相对而言重 组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。
成。
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（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 用于已知序列，或可推导出序列的基因
2. 基因组DNA 基因组DNA文库（genomic DNA library
）
3. cDNA
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基因组DNA文库
组 织 或 细 胞 染 色 体 D N A
存在于转化细菌内，
限 制 性 内 切 酶
由克隆载体所携带的所 基因片段
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❖ 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的 切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种 。
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DNA连接酶
❖ 连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末 端连接起来，使之成为一个完整的DNA分 子。
❖ 连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。
❖ DNA连接酶的作用过程
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工程菌不稳定性的原因
工程菌稳定与否，与重组质粒本身的分子组成 、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等因素 有关。
• 质粒本身的分子结构：引起工程菌不稳定常 常是由于稳定区受到影响。另外可能由于重 组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部 分同源等都会造成质粒的不稳定
• 宿主：除上述质粒中有同源序列外，还与宿 20主20/3/的31 比生长速率、宿主中重组基因(rec系统41 )
酶 切 反 应 体 系（ 20 uL ）
管号
核酸
10xbuff ddH Bam HandI erK 2O HI II
目的基 tub 因 AKP e1
16 uL
2 uL
0 uL 1 uL 1 uL
370C酶10解u3小L 时
pETBlu
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酶切片段的回收
• PCR产物快速胶回收试剂盒
3)具有某些标记基因
3. 种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。
4. 质粒的特点 2020/3/31
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质粒
细胞染色体外能自主复制的小型 环状DNA分子；
质粒是基因工程中最常用的运载 体；
最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； 存在于许多细菌及酵母菌等生物
中； 质粒的存在对宿主细胞无影响； 质粒的复制只能在宿主细胞内完
• C．营养缺陷型法 与上述抗生素依赖变异法相类似。其原
理是通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该基
因插入到重组质粒中，然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细
20胞20/不3/3能1 存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。
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防止或降低工程菌的不稳定性(续)
• （4） 控制基因过量表达 提高质粒稳定性的目的是为了
G GATC GCGAT CCTG AGCCTG AG
DNA连接酶
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GGATCC
CCTG AG
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（四）重组DNA导入受体菌
导入方式：
转化 转导
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（五）重组体的筛选
重组DNA导入受体菌后，经过培 养使其大量繁殖，再设法将含有目的 基因的菌落区分鉴定出来，这一过程 即为筛选（screening）或选择（selection）。
②限制酶截取 DNA片断
③分离大肠杆 菌中的质粒
④ DNA重组
⑤用重组质粒 转化大肠杆菌
⑥培养大肠杆菌 克隆大量基因5
基因工程过程流程图
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限制性内切酶
1. 分布：主要在微生物中。 2. 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切 割特定切点。 3. 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 4. 举 例 ： 大 肠 杆 菌 的 一 种 限 制 酶 能 识 别 GAATTC序列，并在G和A之间切开。
含 重 组 分 子 的 转 化 菌
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PCR
PCR是根据DNA复制的原理，在体外利用
酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA
的专门技术。
PCR的反应体系：模板DNA、特异性引物 、
DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸(dNTP) 及含有
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2＋
PCR的基本反应步骤：
1. 变性：将反应系统加热至95℃ ，使 模板DNA完全变性成为单链；
提高克隆菌的发酵生产率，但许多研究中发现，外源基因表达水平越高 ，重组质粒往往越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒 不可能丢失。
• （5）控制培养条件 克隆菌所处的环境条件对其质粒的稳
定性和表达效率影响机制错综复杂的而众多的环境因素中，培养基组成 、培养温度、菌体的比生长速率三方面尤为重要，对已经组建完成的克 隆菌来说，选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。
菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，可阻止丢失了重组质粒 的非生产菌的生长。
• B．抗生素依赖变异法 即通过诱变使宿主细胞成为某抗
生素的依赖性突变株，只有存该抗生素存在时宿主细胞才能生长，而重 组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后， 所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。
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1. 直接选择法： 针对载体携带某种或某些标志基因 和目的基因而设计的筛选方法。其特 点是直接测定基因或基因表型。
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抗药性标记选择（插入失活法）：
将目的基因插入带ampr和tetr基因的载 体中，则tetr基因失活。在分别 含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中 培养，进行筛选。
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DNA连接酶的作用过程
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运载体
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物 体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞 内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。
1. 作用：将外源基因送入受体细胞。
2. 条件：
1)能在宿主细胞内复制并稳定地保存。
2)具有多个限制酶切点。
2. 退火：将温度下降至50℃左右，使引 物与模板DNA退火结合；
3. 延伸：将温度升至72℃ ，DNA聚合酶 以dNTP为底物催化DNA的合成反应。
2020上/3/31述三个步骤为一个循环，经25～30次循17
（二）克隆载体的选择
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（三）外源基因与载体的连接
粘性末端连接
GGATCC GGATCC CCTAGG CCTAGG
工程菌不稳定性的表现(倾向)
工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产 物的不稳定两个方面。
• 质粒的丢失；
– 由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两
种菌的混合物。在非选择性条件下，含有重组质
粒的工程菌的比生长速率往往小于不含重组质粒
的比生长速率，即宿主细胞的生长优势对工程菌
2020/3/的31 发酵极为不利。
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菌落(或噬菌体)原位杂交
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2. 非直接选择法：
免疫学方法：利用特异抗体与目的 基因表达产物相互作用进行筛选。包括：
免疫化学方法 酶免检测法
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（六）克隆基因的表达
表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离、纯化
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标志补救（marker rescue）
若目的基因能够在宿主菌表达，且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对 营养素的依赖表型来筛选。
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分子杂交法：
利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素 膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子 杂交，直接选择并鉴定目的基因。
“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组
合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重
组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的
基因产物（70年代，基于DNA限制新性内切
酶、DNA连接酶的发现） 。
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基因工程过程示意图
① ②
③ ④
⑤ ⑥
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①从细胞中分 离出DNA
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菌种退化原因
• 基因突变 – 自发负突变 – 回复突变：生产株成为野生型
• 分离现象：多核（或单核）但是DNA双链之一发生 突变，随着传代，核发生分离，导致突变基因和未 突变基因的分离。
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菌种保藏的原理和方法
• 原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点 ，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动 尽量降低，以减少其变异。 一般可通过 – 保持培养基营养成分在最低水平 – 缺氧状态 – 干燥和低温 使菌种处于“休眠’状态，抑制其繁殖能力。
有基因组DNA的集合。
克隆载体
简称G－文库。
重 组 DNA分 子
受体菌
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含 重 组 分 子 的 转 化 菌 14
cDNA文库
mRNA
逆转录酶
用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后， 建立的基因文库。简称 c－文库。
cDNA
复制
双链cDNA 载体
重 组 DNA分 子
受体菌
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举例：碱性磷酸酶基因工程菌的构建
• 1 PCR基因扩增及扩增产物的回收-碱性磷酸 酶基因获得
2000bp 1000bp
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PCR 扩增产物电泳结果
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2 质粒DNA的提取
–从含pETBlue-2(或pET21a)质粒的K12菌株提 取
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3 DNA重组－限制性酶切和连接 酶切
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大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化
感受态（Competence)： NovaBlue是一种适合用作初始克隆宿主菌的K-12 菌株，细菌处于容易吸收外源DNA的状态
转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程
致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作
转化的确切机制还不清楚
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重组子筛选-蓝白筛选
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DNA重组－重组子的筛选及表达菌株的转化
• 重组质粒的提取 • 表达菌株感受态细胞的制备 • 转化及复苏
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外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
• SDS－PAGE
• 免疫分析
细胞 破碎
蛋白 分离
细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗 DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理, 促进细胞吸收DNA复合物
复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再 转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌 落
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连接
目的基因 AKP
12 uL
连 接 反 应 体 系（ 20 uL ）
载体 pETBlue-2 or pET-21a
10 x Ligase buffer
ddH2O T4DNA连接酶
X uL
2 uL
Y uL
1 uL
Fra Baidu bibliotek
♦ 140C连接过夜。 ♦ －200C保存，用于转化受体细胞。
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• （6）可转移性因子会促进插入和丢失的出现，因此所使用
的质粒不应带有可转移因子。
• （7）冗长的DNA对宿主细胞是一种负担，尽可能将质粒上的不需要的 DNA部分除去。
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2.2.7 菌种保藏
• 菌种保藏的目的
– 保持菌种的活力，不死亡。 – 保持菌株的纯净，不被污染。 – 保持菌株不变异，不退化。
• (3)施加选择压力 在重组DNA技术中，有好几个方面利用选
择压力，如转化后用选择压力确定含有重组质粒的克隆株，而在利用克
隆菌进行发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的不
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稳定，以提高菌体纯度和发酵生产率。
施加选择压力
• A 抗生素添加法 通常在重组质粒上含有抗药性基因。在克隆