实验三大鼠糖尿病模型的复制

3 载玻片和盖玻片的处理： （1）清洗：新载玻片上有油污，必须经过清洁液浸泡 12～24h，流水充分漂洗后用蒸馏水清洗5遍以上，浸泡 在95%酒精内2h，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干均可， 贮放于玻片盒内备用。盖玻片很薄，以上处理程序必须 缩短，清洁液浸泡只需2h，流水冲洗注意勿损伤玻片等。 （2）载玻片上涂粘附剂：多聚赖氨酸液：多聚赖氨酸 0.1g，加蒸馏水10ml，混合后即可涂片。
冰冻切片前处理
1取材：组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标 本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组 织，后者是机体死亡2h以上的组织，可能有不同程度的自溶， 其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应 尽快固定处理， 2固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止 组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。 固定液：4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛 40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，两者混合加热至60℃， 搅拌并滴加1n NaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量 1000ml）。 方法：浸入法，将组织浸泡在固定液中
操作方法：
Ⅰ型糖尿病造模方法：
1. 链脲佐菌素(stz)建模，造模前的喂养 Ⅰ型糖尿病模型成模比较快，通常大鼠在普通饲 料适应性喂养2周后即可开始造模。禁食12小时以 上(一般过夜禁食，不禁水)。禁食的时间越长， STZ对胰岛β细胞的破坏力越明显，即药效越高。 所以相对禁食时间延长，可以降低STZ的用量。 2. 测正常大鼠血糖，给药，链脲菌素溶于枸缘酸缓 冲液或柠檬酸缓冲液（pH值为4.0－4.5）中， 70~65mg/kg给大鼠腹腔注射；35、45、55、 65mg/kg（0.35、0.45、0.55、0.65ml/100g）。
Ⅱ型糖尿病造模方法：
高脂饮食诱导加小剂量STZ。造模前喂以高脂 (高糖)饲料，诱发出胰岛素抵抗。 Wistar大鼠或 SD大鼠分别高糖高脂饲料喂养4、6、8 周后,采 血检测空腹血糖及血清胰岛素。禁食12小时以上， 按30mg/kg体重剂量一次性腹腔内注射链脲佐菌 素,7d后再次采血检测糖尿病鼠空腹血糖及血清胰 岛素。最后可处死动物，解剖，取胰腺，做病理 切片，苏木素-伊红（HE）染色，观察胰岛细胞 结构病理变化。
Ⅰ型糖尿病与Ⅱ型糖尿病动物模型的制备与 STZ注射的剂量有关系： Ⅰ型糖尿病模型：大鼠剂量为70～65mg/Kg Ⅱ型糖尿病模型：高糖高脂喂养1～2 个月的 大鼠,STZ 剂量在25～40mg/Kg （本剂量以200克均重为例）。
大剂量注射时，由于直接引起胰岛β细 胞的广泛破坏，可造成1型糖尿病模型；而 注射较少量STZ时，由于只是破坏一部分胰 岛β细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不 敏感，同时给予高热量饲料喂养，两者结 合便诱导出病理、生理改变都接近于人类2 型糖尿病的动物模型。
胰腺表面覆以薄层结缔组织被膜，结缔组织伸入腺 内将实质分隔为许多小叶，但人胰腺小叶分界不明显。 腺实质由外分泌部和内分泌部两部分组成。外分泌部分 泌胰液，含有多种消化酶，经导管排入十二指肠，在食 物消化中起重要作用。内分泌部是散在于外分泌部之间 的细胞团，称胰岛，它分泌的激素进入血液或淋巴，主 要参与调节碳水化合物的代谢
切片制作：（1）速冻，使组织温度骤降， 置入恒冷箱切片 机冰冻切片。 厚度：5-7um 贴片：粘贴在载玻片上，风干4-6h， HE染色
（1）自来水浸泡30s，苏木精液染色1-2min （2）自来水浸泡洗去苏木精液 30 s （3）1%盐酸乙醇 15-20 s （4）自来水浸泡20 s （5）稀氨水30 s （6）自来水浸泡20 s （7）伊红液染色 30～60 s （8）自来水浸泡30 s （9）80%乙醇 20 s （10）90%乙醇 30 s (11) 95%乙醇1min （12）无水乙醇 Ⅰ1min (13)无水乙醇Ⅱ2min （14）二甲苯Ⅰ 1min （15）二甲苯 Ⅱ 2min （16）二甲苯Ⅲ 2min （17）中性树胶封固。
大鼠糖尿病模型的复制
实验原理：
目前糖尿病模型的复制（以大鼠为例），多采 用链脲菌素，链脲佐菌素(STZ)对一定种属动物的 胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱发许多动物 产生糖尿病，注射给药后会出现血糖呈三相性变 化，即用药后2－3小时后出现初期高糖期，持续 6－12小时后进入低血糖期，动物出现痉挛，24 小时后，一般为持续性高血糖期，发生糖尿病。
ห้องสมุดไป่ตู้
实验结果：
糖尿病鼠血糖及血清胰岛素均显著高于对照组。 对照组大鼠胰腺为圆形或椭圆形的细胞团，分散于 胰腺泡之间，B细胞数量较多，胞质丰富，核圆形， 无包膜，细胞团块大小不一；实验组胰岛萎缩，数 量减少，分布稀疏，胰岛细胞发生退行性改变，数 量减少，胰岛中B细胞数量减少，B细胞数量仅在 正常的10%以下，细胞皱缩，呈条束状而变窄。萎 缩的小岛细胞形态较小，核致密，胞浆少, 肿胀，胞质着色浅，细胞核圆缩，胰岛间质纤维化。
3. 2－3小时后，采血，化验血糖，观察血糖变化。 4. 24小时后，采血，化验血糖，观察血糖变化。 5. 72小时小时后，采血，化验血糖，观察血糖变化。 6. 一周后测血糖，处死动物，解剖，取胰腺，固定， 制备冰冻切片 ，切片厚度5µm，贴片，干燥，常用 苏木素-伊红（HE）染色，观察胰岛细胞结构病理变 化。