二硫键的定位修饰

蛋白质药物的二硫键定点修饰摘要：蛋白质中的二硫键在蛋白质分子的立体结构形成上起着重要作用，通过合适的策略可用于定点修饰。本文简要介绍了利用蛋白质原生二硫键对其进行定点修饰的策略和实施方法，并讨论了该方法的有效性。

前言

蛋白质和多肽药物(以下简称蛋白质药物)具有作用位点专一、疗效明确等优点，用于各种疾病治疗的蛋白质药物研制及应用已经成为生物医药产业发展的热点。蛋白质药物的聚乙二醇修饰，是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上，可以有效地解决蛋白质药物所存在的半衰期短、酶稳定性差、具有免疫原性等问题[1, 2]。

自1977年PEG用于修饰牛血清白蛋白以来，已有许多不同种类的活化PEGs 被成功地开发并用于蛋白质修饰。PEG修饰技术也经历了两个发展阶段,即以传统的随机修饰为特点的第一代PEG修饰技术和以定点修饰为特点的第二代PEG 修饰技术。相对于随机修饰，定点修饰能够针对特定基团或专一位点进行修饰，有利于保持蛋白质药物的活性，产物易于表征，产品质量更容易控制，已成为PEG修饰蛋白质药物的研究热点[3]。

为了达到这一目标，研究者们设计了不同的合成策略并合成了相应的PEG 修饰剂，不断探索蛋白质药物定点修饰的方法[4,5]。其中，对于含有自由巯基的半胱氨酸的残基的蛋白质药物，可以利用巯基的高反应活性，选取能够特异性与巯基偶联的PEG修饰剂，能够高效地对蛋白质进行定点修饰。然而，蛋白质分子中的半胱氨酸残基数量较少且很少以游离形式存在，虽然可以通过基因工程准确将半胱氨酸引入到蛋白质药物预先设计的位置，但这在技术上和成本上均有较高的要求。另外，在蛋白质的纯化过程，过多的自由巯基将导致二硫键形成，蛋白质空间结构改变，以及蛋白质的不可逆聚集。

虽然利用自由巯基定点修饰蛋白质的方法困难重重，研究者发现大多数蛋白质都具有的二硫键更适于用来定点修饰，可以通过化学还原，使二硫键释放出两个巯基，从而进行定点修饰。但在一些蛋白质分子中，二硫键在稳定其二级和三级结构上起着关键的作用，对二硫键修饰极有可能导致其活性丧失。因此，开发

针对二硫键的高效活化PEG修饰剂及可行的修饰策略成为实现定点修饰的关键[6-8]。

修饰策略

对蛋白中含有的二硫键进行PEG定点修饰分为2 个步骤：首先利用温和的还原剂使二硫键还原释放两个硫氢基；第二步通过PEG修饰剂的双烷基化反应能够将还原后的二硫键的两个巯基分别烷基化形成三碳桥，PEG通过三碳桥与蛋白质共价偶联。三碳桥能够在一定程度上替代二硫键，从而完成PEG的定点修饰。在修饰蛋白过程中不会出现蛋白的不可逆变性，而且二硫键还原后蛋白仍维持其三级结构，PEG选择性的修饰两个巯基，PEG的立体屏障作用确保1 个二硫键只结合1 分子PEG。此种针对蛋白质二硫键进行定点修饰的策略已成功应用于多种细胞因子、酶及抗体片断的修饰，结果表明此方法定点PEG 化蛋白质，产率较高且未破坏蛋白质的三级结构，生物活性也得到较好的保持[7]。

Fig 1 修饰策略示意图及PEG衍生物的合成路线

这种方法已经成功应用于干扰素、生长抑素、天冬酰胺酶、谷胱甘肽等蛋白质药物的定点修饰。下面以IFN-α-2b为例来进一步说明蛋白质的二硫键定点修饰。

IFN α-2b是一个典型的具有四螺旋束的蛋白质，含有两个可用于定点修饰的二硫键。因此，用一当量的PEG衍生物对其进行修饰，得到的是两种异构体；

采用两当量的PEG衍生物进行修饰，两个二硫键均会参与反应，便可得到双修饰的IFN α-2b。如Fig2所示。

Fig 2、PEG-IFN-PEG的结构图示意图[6]

如Fig 3所示，IFN与一当量的PEG衍生物反应，得到了两种单修饰IFN以及少量双修饰IFN的混合物。这结果与SEC-HPLC分析的数据是一致的

（PEG-IFN Cys1-CC[PEG]C-Cys98 orCys29-CC[PEG]C-Cys138，65%，

PEG-IFN-PEG Cys1-CC[PEG]C-Cys98 and Cys29-CC[PEG]C-Cys138, 23.5%，IFN 4.9%，聚集的IFN6.6%）。

Fig 3. PEG修饰产物的电泳图：1、20K PEG衍生物；2、IFN；3、二硫键被一当量小分子修饰还原后的IFN；4、PEG修饰IFN的混合物；5、二硫键全部被还原的IFN[7]。

虽然，二硫键是蛋白质一级结构的组成部分，但它却是继蛋白质的二级、甚至三级结构形成之后形成的，对蛋白的结构和功能中起重要作用。在IFN中，二硫键对其螺旋结构起着决定性的影响，学者们也对通过二硫键定点修饰后的IFN的螺旋结构进行了研究。圆二色谱实验发现，这种修饰方法并不会导致IFN、生长抑素、天冬酰胺酶等的螺旋结构发生变化。体外抗病毒活性的实验发现，修饰后IFN其活性有所下降。但是PEG链长度对于其生物活性并没有显著的影响。这种修饰方法得到的PEG-IFN的生物活性约为IFN的8%，略高于目前临床中使用的PEG-IFN（约为IFN的7%），可以满足临床使用的要求。

小结

二硫键广泛存在于蛋白质药物之中，对蛋白质的二级结构和三级结构具有重要影响。二硫键还原之后得到具有高反应活性的巯基，可以用于PEG的定点修饰，然后通过重建三碳桥的方法替代了二硫键对蛋白质结构的作用。实验证明，通过二硫键对蛋白质进行定点修饰的方法，具有反应效率高、产物易于分离、蛋白质的生物活性满足临床使用等优点，具有广泛的应用前景。

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参考文献：

1. Greenwald, R.B., Choe, Y.H., McGuire, J. & Conover, C.D. Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 217–250 (2003).

2. Veronese, F.M. & Pasut, G. PEGylation, successful approach to drug delivery. Drug Discov. Today 10, 1451–1458 (2005).

3. hapman, A. PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: a review. AdV. Drug DeliVery ReV. 54, 531-545. (2002)