花青素抗氧化损伤及细胞凋亡的作用研究
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花青素抗氧化损伤及细胞凋亡的作用研究 3
中西医结合肝病杂志 2009年第 19卷第 1期
·基础理论研究 ·
余 晶 1△ 鲍中英 2 徐玉敏 2 V ladim ir Khaoustov2 Boris Yoffe2
11广西中医学院第一附属医院肝病内科 (广西 南宁 , 530023) 21Department of M edicine, M ichael E1DeBakey Veterans AffairsM edical Center, Baylor College of M edicine, Houston; TX1U1S1A177030
seph, J1A[4 ]建立的荧光 DCFH 2DA 荧光分光光度法检测 。用 黑色 96孔板 , Huh7细胞按 1 ×104 /m l的浓度接种于每孔 , 过 夜 , 去掉原培养液 , 换为无血清培养液 。设置空白对照 , 未 处理细胞对照 , 花青素浓度 0～50μmol/L , 花青素提前孵育 3 小时后加入 DCFH2DA ( Sigma公司 ) 5μmol/L 终浓度 , 孵育 30分钟后 , 去掉含 DCFH 2DA 的培养液 , 用 37℃ DM EM 清 洗 。在 H2O2 处 理 组 和 共 同 处 理 组 加 入 H2O2 最 终 浓 度 018mmol/L , 孵育 30分钟 。用荧光分光光度计检测其荧光强 度 , 激发光 485nm /发射光 535nm。 115 免疫印迹试验 将 Huh7细胞以 3 ×106 /m l的浓度接种 于 8个 10cm 直径培养器中 , 细胞达到 80% ～90%铺满时 , 首 先用 011mmol/L到 614mmol/L H2O2 处理细胞 1小时 , 另设未 处理对照细胞 , 共 8 种不同处理 , 分别测定 Akt和磷酸化 c2 Jun ( Ser63) 。
花青素 ( cyanidin) 是存在于植物中的黄酮类 , 在葡萄 、 紫甘蓝 、红心萝卜 、紫苏 、黑米和黑豆中含量都很高 。黄酮 类和其他植物中的多酚化合物具有多种生物学活性 , 包括抗 氧化 、抗炎症 、抗微生物 、抑制血小板凝聚和抗肿瘤活性 。 流行病学调查表明食物中的黄酮类可减少慢性疾病包括癌症 的发生 [1 ] 。花青素诱导癌细胞凋亡已经有报道 [2 ] , 为了解花 青素对 肝 细 胞 在 氧 化 应 激 中 的 作 用 , 本 研 究 以 H2O2 诱 导 Huh7细胞氧化损伤 , 制成肝细胞氧化应激和凋亡模型来观察 花青素对肝细胞在氧化应激下受损的防护作用及其作用机制 。 1 材料与方法 111 材料 花青素 、H2O2 从 Sigma公司购买 。花青素溶解在 乙醇中 。花青素储存液的浓度为 10mmol/L , 储存于 - 20℃备 用 。 30% 的 H2O2 在 每 次 使 用 前 用 无 菌 蒸 馏 水 稀 释 为 100mmo l /L。 112 细胞培养及分组处理 人肝肿瘤来源的细胞系 Huh7细 胞 , 在含有 10%小牛血清 、100U /L 青霉素 、100mg/L 链霉素 的 DM EM 培养液中常规培养 。设定无细胞空白对照 、细胞未 处理对照 、相同浓度溶媒处理对照 、花青素处理 、H2O2 处理 和花青素加 H2O2 处理等 6组 。用 018mmol/L H2O2 来诱导细 胞氧化应激是根据文献 [3 ]的资料和实验结果 。 113 细胞增殖检测 (M TT) 试验 应用细胞增殖试验作为细 胞生存的指针 。M TT试剂盒根据厂家 ( Roche D iagnostics公 司 , 批号 : 11465007001 ) 说 明 书 进 行 操 作 。将 细 胞 以 每 孔 015～1 ×104 /m l的密度接种于 96 孔板 , 置于 37℃, 含 5% CO2 潮湿培养箱内培养过夜 , 细胞贴壁后 , 加入不同浓度的 花青素孵育 24小时 , 首先观察 Huh7细胞对不同浓度花青素 的反应 。选出毒性最小 , 细胞增殖率最高的浓度 , 作为花青 素的试验 剂量 , 以进行后续试验 。以不同 浓 度 的 花 青 素 与 018mmol/L H2O2 共同孵育 Huh7 细胞 , 选出最适合的花青素 剂量作为保护细胞的剂量 。实验基本过程 : 细胞接种于 96孔 板 , 在细胞培养箱过夜后 , 去掉培养液 , 换成无血清培养液 。 花青素提前孵育 23 小时 , 然后加入 018mmol/L H2O2 培养 1 小时 , 去掉培养液后 , 加入无血清 DM EM , 每孔加入 5mg/m l M TT 10μl继续培养 4 小时 , 有紫色结晶形成后 , 每孔加入 10% SDS 100μl, 细胞置于培养箱内经过 12小时后 , 用微孔 分光光 度 计 测 定 样 本 的 光 密 度 A (吸 光 度 ) 。检 测 波 长 : 560nm , 参比波长 : 690nm。相同处理的细胞重复设置 6 ～8 孔 , 以减少误差 。细胞存活率 = [实验组 A (吸光度 ) /对照 组 A (吸光度 ) ] ×100%。 114 细胞内 ROS水平测定 细胞内 ROS水平按 W ang and Jo2
Key W ords cyanidin; oxidative stress; apop tosis; phosphory2c2Jun
3 基金项目 : 广西教育厅广西财政资助出国留学项目 [桂教国交 (2005) 85 ] △通讯作者 : 电话 : 077125848503; E2mail: jingy1237@1261com
关键词 花青素 ; Huh7细胞 ; 细胞内活性氧 ; 磷酸化 c2Jun
Cyan id in a ttenua ted H2O2 2induced ox ida tive stress in Huh7 cell by inh ib iting phosrela te2c2Jun and RO S production
Abstract O bjective: Apop tosis induced by oxidative stress p lays an important role in the pathogenesis of various liver dis2 eases1Ep idem iological studies demonstrated that dietary flavonoids including cyanidin m ight reduce the risk of chronic disea2 ses1The aim of this study was to investigate the molecular mechanism s involved in anti2apop totic effects of ep icathechin in liver cells1M ethods: Human hepatoma cell line ( Huh7 ) was treated w ith 018mmol/L H2O2 for 1 hour to induce apop to2 sis1 Intracellular generation of reactive oxygen species (ROS) was detected w ith DCFH 2DA assay1Cell p roliferation was measured by M TT assay1The exp ression of phospho2c2Jun MAPK and the levels of Akt, PCNA were assessed by W estern2blot analysis1Results: H2O2 2dependent intracellular ROS p roduction was 72fold higher as compared to untreated cells, consequently resulting in 50% reduction of cell viability1 Interestingly, p retreatment of cells w ith cyanidin resulted in a dose2dependent inhibi2 tion of H2O2 2induced ROS generation and reduced cell apop tosis by three2fold as compared to H2O2 treatment alone1 In addition cyanidin reduced phospho2c2Jun MAPK exp ression, but increased Akt level1Conclusion: Cyanidin p rotects Huh7 cells from ox2 idative stress induced apop tosis1The molecular mechanism s of anti2apop totic effects of cyanidin are associated w ith inhibition of c2 Jun phosphorylation and p romote of Akt exp ression and reduction of ROS p roduction1These findings imp licate ep icathechin m ight have potential as p rotective agent against a variety of oxidative stress2mediated liver conditions1
J IN G YU1△, ZHON G Y IN G2BAO2 , YU M IN 2XU2 , et a l111Hepa tology D epa rtm en t, the first affilia ted hospita l to Guangx i Ch i2 nese m ed ica l un iversity (N ann ing Guangxi, 500023 ) Ch ina; 21D epa rtm en t of M ed icine, M ichael E1D eB akey V eterans A ffa irs M ed ica l Cen ter, B aylor College of M ed icine, Houston; TX1U 1S1A, 77030
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
中西医结合肝病杂志 2009年第 19卷第 1期
பைடு நூலகம்
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凋亡在肝脏的病理和生理过程中起了重要的作用 。自由 基特别是活性氧 ( ROS) 是诱发凋亡的常见原因 。增加自由 基的产生或降低抗氧化抵抗系统可增加氧化应激 。肝脏炎症 、 中毒 、淤胆 、缺血再灌注 、免疫反应 、饮酒都可以使肝细胞 处于氧化应激状态 。这种状态可导致慢性肝炎 , 酒精肝 , 肝 硬化和肝癌 。从治疗的角度分析 , 干预肝细胞的凋亡将有利 于防治慢性肝脏疾病 。
摘 要 目的 : 探索花青素对 H2O2 引起的 Huh7细胞氧化应激 、细胞凋亡的作用及其机制 。方法 : 对 H2O2 和花 青素干预培养的 Huh7细胞 , 应用 M TT法检测细胞活力 , 荧光探针 DCFH2DA 测定细胞内活性氧 ( ROS) 生成量 , 免 疫印迹测定 Akt、磷酸化激活的 c2Jun蛋白水平 。结果 : H2O2 018mmol/L孵育 1小时可显著诱导 Huh7细胞损伤 , 细胞 活力下降到 (49127 ±312) % , ROS生成量是未处理细胞的 3156倍 。细胞经花青素 50μmol/L与 H2O2 共孵育后 , 细胞 存活率提高到 (8112 ±2134 ) % ; 花青素能显著抑制 H2O2 引起的 Huh7 细胞 ROS生成 , ROS生成下降 74% ( P < 0101) 。花青素抑制 H2O2 引起 Huh7细胞死亡和 ROS生成的效应随剂量增加而加强 。花青素抑制 H2O2 激发 Huh7细 胞磷酸化 c2Jun表达 , 提高细胞 Akt水平 。结论 : 花青素抑制 H2O2 引起的 Huh7 细胞氧化应激损伤所导致的细胞死 亡 , 其作用机制在于减少细胞内活性氧生成 , 抑制 H2O2 激活磷酸化 c2Jun, 提高细胞 Akt水平 。
花青素抗氧化损伤及细胞凋亡的作用研究 3
中西医结合肝病杂志 2009年第 19卷第 1期
·基础理论研究 ·
余 晶 1△ 鲍中英 2 徐玉敏 2 V ladim ir Khaoustov2 Boris Yoffe2
11广西中医学院第一附属医院肝病内科 (广西 南宁 , 530023) 21Department of M edicine, M ichael E1DeBakey Veterans AffairsM edical Center, Baylor College of M edicine, Houston; TX1U1S1A177030
seph, J1A[4 ]建立的荧光 DCFH 2DA 荧光分光光度法检测 。用 黑色 96孔板 , Huh7细胞按 1 ×104 /m l的浓度接种于每孔 , 过 夜 , 去掉原培养液 , 换为无血清培养液 。设置空白对照 , 未 处理细胞对照 , 花青素浓度 0～50μmol/L , 花青素提前孵育 3 小时后加入 DCFH2DA ( Sigma公司 ) 5μmol/L 终浓度 , 孵育 30分钟后 , 去掉含 DCFH 2DA 的培养液 , 用 37℃ DM EM 清 洗 。在 H2O2 处 理 组 和 共 同 处 理 组 加 入 H2O2 最 终 浓 度 018mmol/L , 孵育 30分钟 。用荧光分光光度计检测其荧光强 度 , 激发光 485nm /发射光 535nm。 115 免疫印迹试验 将 Huh7细胞以 3 ×106 /m l的浓度接种 于 8个 10cm 直径培养器中 , 细胞达到 80% ～90%铺满时 , 首 先用 011mmol/L到 614mmol/L H2O2 处理细胞 1小时 , 另设未 处理对照细胞 , 共 8 种不同处理 , 分别测定 Akt和磷酸化 c2 Jun ( Ser63) 。
花青素 ( cyanidin) 是存在于植物中的黄酮类 , 在葡萄 、 紫甘蓝 、红心萝卜 、紫苏 、黑米和黑豆中含量都很高 。黄酮 类和其他植物中的多酚化合物具有多种生物学活性 , 包括抗 氧化 、抗炎症 、抗微生物 、抑制血小板凝聚和抗肿瘤活性 。 流行病学调查表明食物中的黄酮类可减少慢性疾病包括癌症 的发生 [1 ] 。花青素诱导癌细胞凋亡已经有报道 [2 ] , 为了解花 青素对 肝 细 胞 在 氧 化 应 激 中 的 作 用 , 本 研 究 以 H2O2 诱 导 Huh7细胞氧化损伤 , 制成肝细胞氧化应激和凋亡模型来观察 花青素对肝细胞在氧化应激下受损的防护作用及其作用机制 。 1 材料与方法 111 材料 花青素 、H2O2 从 Sigma公司购买 。花青素溶解在 乙醇中 。花青素储存液的浓度为 10mmol/L , 储存于 - 20℃备 用 。 30% 的 H2O2 在 每 次 使 用 前 用 无 菌 蒸 馏 水 稀 释 为 100mmo l /L。 112 细胞培养及分组处理 人肝肿瘤来源的细胞系 Huh7细 胞 , 在含有 10%小牛血清 、100U /L 青霉素 、100mg/L 链霉素 的 DM EM 培养液中常规培养 。设定无细胞空白对照 、细胞未 处理对照 、相同浓度溶媒处理对照 、花青素处理 、H2O2 处理 和花青素加 H2O2 处理等 6组 。用 018mmol/L H2O2 来诱导细 胞氧化应激是根据文献 [3 ]的资料和实验结果 。 113 细胞增殖检测 (M TT) 试验 应用细胞增殖试验作为细 胞生存的指针 。M TT试剂盒根据厂家 ( Roche D iagnostics公 司 , 批号 : 11465007001 ) 说 明 书 进 行 操 作 。将 细 胞 以 每 孔 015～1 ×104 /m l的密度接种于 96 孔板 , 置于 37℃, 含 5% CO2 潮湿培养箱内培养过夜 , 细胞贴壁后 , 加入不同浓度的 花青素孵育 24小时 , 首先观察 Huh7细胞对不同浓度花青素 的反应 。选出毒性最小 , 细胞增殖率最高的浓度 , 作为花青 素的试验 剂量 , 以进行后续试验 。以不同 浓 度 的 花 青 素 与 018mmol/L H2O2 共同孵育 Huh7 细胞 , 选出最适合的花青素 剂量作为保护细胞的剂量 。实验基本过程 : 细胞接种于 96孔 板 , 在细胞培养箱过夜后 , 去掉培养液 , 换成无血清培养液 。 花青素提前孵育 23 小时 , 然后加入 018mmol/L H2O2 培养 1 小时 , 去掉培养液后 , 加入无血清 DM EM , 每孔加入 5mg/m l M TT 10μl继续培养 4 小时 , 有紫色结晶形成后 , 每孔加入 10% SDS 100μl, 细胞置于培养箱内经过 12小时后 , 用微孔 分光光 度 计 测 定 样 本 的 光 密 度 A (吸 光 度 ) 。检 测 波 长 : 560nm , 参比波长 : 690nm。相同处理的细胞重复设置 6 ～8 孔 , 以减少误差 。细胞存活率 = [实验组 A (吸光度 ) /对照 组 A (吸光度 ) ] ×100%。 114 细胞内 ROS水平测定 细胞内 ROS水平按 W ang and Jo2
Key W ords cyanidin; oxidative stress; apop tosis; phosphory2c2Jun
3 基金项目 : 广西教育厅广西财政资助出国留学项目 [桂教国交 (2005) 85 ] △通讯作者 : 电话 : 077125848503; E2mail: jingy1237@1261com
关键词 花青素 ; Huh7细胞 ; 细胞内活性氧 ; 磷酸化 c2Jun
Cyan id in a ttenua ted H2O2 2induced ox ida tive stress in Huh7 cell by inh ib iting phosrela te2c2Jun and RO S production
Abstract O bjective: Apop tosis induced by oxidative stress p lays an important role in the pathogenesis of various liver dis2 eases1Ep idem iological studies demonstrated that dietary flavonoids including cyanidin m ight reduce the risk of chronic disea2 ses1The aim of this study was to investigate the molecular mechanism s involved in anti2apop totic effects of ep icathechin in liver cells1M ethods: Human hepatoma cell line ( Huh7 ) was treated w ith 018mmol/L H2O2 for 1 hour to induce apop to2 sis1 Intracellular generation of reactive oxygen species (ROS) was detected w ith DCFH 2DA assay1Cell p roliferation was measured by M TT assay1The exp ression of phospho2c2Jun MAPK and the levels of Akt, PCNA were assessed by W estern2blot analysis1Results: H2O2 2dependent intracellular ROS p roduction was 72fold higher as compared to untreated cells, consequently resulting in 50% reduction of cell viability1 Interestingly, p retreatment of cells w ith cyanidin resulted in a dose2dependent inhibi2 tion of H2O2 2induced ROS generation and reduced cell apop tosis by three2fold as compared to H2O2 treatment alone1 In addition cyanidin reduced phospho2c2Jun MAPK exp ression, but increased Akt level1Conclusion: Cyanidin p rotects Huh7 cells from ox2 idative stress induced apop tosis1The molecular mechanism s of anti2apop totic effects of cyanidin are associated w ith inhibition of c2 Jun phosphorylation and p romote of Akt exp ression and reduction of ROS p roduction1These findings imp licate ep icathechin m ight have potential as p rotective agent against a variety of oxidative stress2mediated liver conditions1
J IN G YU1△, ZHON G Y IN G2BAO2 , YU M IN 2XU2 , et a l111Hepa tology D epa rtm en t, the first affilia ted hospita l to Guangx i Ch i2 nese m ed ica l un iversity (N ann ing Guangxi, 500023 ) Ch ina; 21D epa rtm en t of M ed icine, M ichael E1D eB akey V eterans A ffa irs M ed ica l Cen ter, B aylor College of M ed icine, Houston; TX1U 1S1A, 77030
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
中西医结合肝病杂志 2009年第 19卷第 1期
பைடு நூலகம்
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凋亡在肝脏的病理和生理过程中起了重要的作用 。自由 基特别是活性氧 ( ROS) 是诱发凋亡的常见原因 。增加自由 基的产生或降低抗氧化抵抗系统可增加氧化应激 。肝脏炎症 、 中毒 、淤胆 、缺血再灌注 、免疫反应 、饮酒都可以使肝细胞 处于氧化应激状态 。这种状态可导致慢性肝炎 , 酒精肝 , 肝 硬化和肝癌 。从治疗的角度分析 , 干预肝细胞的凋亡将有利 于防治慢性肝脏疾病 。
摘 要 目的 : 探索花青素对 H2O2 引起的 Huh7细胞氧化应激 、细胞凋亡的作用及其机制 。方法 : 对 H2O2 和花 青素干预培养的 Huh7细胞 , 应用 M TT法检测细胞活力 , 荧光探针 DCFH2DA 测定细胞内活性氧 ( ROS) 生成量 , 免 疫印迹测定 Akt、磷酸化激活的 c2Jun蛋白水平 。结果 : H2O2 018mmol/L孵育 1小时可显著诱导 Huh7细胞损伤 , 细胞 活力下降到 (49127 ±312) % , ROS生成量是未处理细胞的 3156倍 。细胞经花青素 50μmol/L与 H2O2 共孵育后 , 细胞 存活率提高到 (8112 ±2134 ) % ; 花青素能显著抑制 H2O2 引起的 Huh7 细胞 ROS生成 , ROS生成下降 74% ( P < 0101) 。花青素抑制 H2O2 引起 Huh7细胞死亡和 ROS生成的效应随剂量增加而加强 。花青素抑制 H2O2 激发 Huh7细 胞磷酸化 c2Jun表达 , 提高细胞 Akt水平 。结论 : 花青素抑制 H2O2 引起的 Huh7 细胞氧化应激损伤所导致的细胞死 亡 , 其作用机制在于减少细胞内活性氧生成 , 抑制 H2O2 激活磷酸化 c2Jun, 提高细胞 Akt水平 。