核酸的分离纯化

核酸的分离与纯化

质、多糖多糖、、脂肪等生物大分子分开脂肪等生物大分子分开。。 在分离核酸时在分离核酸时，，应遵循两个原则应遵循两个原则：：一是保证核酸一级结构的完整性证核酸一级结构的完整性，，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的证核酸样品的纯度证核酸样品的纯度。。

核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料的选择的选择、、核酸的释放核酸的释放、、核酸与其它生物大 合实现合实现。。

临床常见的标本血液、、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定的目的来确定。。

（一）机械法

包括低渗裂解包括低渗裂解、、超声裂解超声裂解、、微波裂解微波裂解、、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。。这些方法用机械力使细胞破碎用于染色体DNA 的分离纯化的分离纯化。。

离子剂使细胞裂解离子剂使细胞裂解，，蛋白质和多糖沉淀蛋白质和多糖沉淀，，核酸被从细胞内释放出来核酸被从细胞内释放出来。。向缓冲液中加入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解保护核酸不被降解。。

破裂破裂，，核酸释放核酸释放。。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质蛋白质，，促进核酸的分离促进核酸的分离。。 胺和N -乙酰胞壁酸残基间的β-1,4 键水解键水解。。蛋白酶K 能催化水解多种肽键能催化水解多种肽键，，且在65℃及有1%Triton X -100 存在时仍保留有酶活性存在时仍保留有酶活性，，对

三、核酸的分离与纯化

（一）核酸分离纯化的基本方法

细胞裂解后离心分离含核酸的水相细胞裂解后离心分离含核酸的水相，，加入等体积的酚等体积的酚∶∶氯仿氯仿∶∶异戊醇混合液异戊醇混合液，，混匀后离心分离后离心分离。。疏水性的蛋白质被分配至有机相机相，，核酸则被留于上层水相核酸则被留于上层水相。。在含核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐分多余的盐分，，即可获得一定纯度的核酸即可获得一定纯度的核酸。。

等。因分离和纯化同步进行因分离和纯化同步进行，，并且有商品试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。。在一定的离子环境下在一定的离子环境下，，核酸可被选择性地

3.密度梯度离心法

双链DNA 、单链DNA 、RNA 和蛋白质具有不同的密度具有不同的密度，，因而可经密度梯度离心适用于大量核酸样本的制备适用于大量核酸样本的制备。。

大量质粒DNA 的首选方法的首选方法。。

氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质，，梯度液中的溴化乙锭与核酸结合梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射产生荧光而析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。

（二）基因组DNA的分离纯化

酶裂解缓冲液裂解细胞酶裂解缓冲液裂解细胞，，经蛋白酶K 处理后理后，，用pH8.0的Tris 饱和酚抽提DNA ，重复抽提至一定纯度后重复抽提至一定纯度后，，根据不同需要行透析或沉淀处理同需要行透析或沉淀处理，，获得所需的

主要试剂的作用主要试剂的作用：：

EDTA ：

二价金属螯合剂二价金属螯合剂，，抑制核酸酶抑制核酸酶；；

SDS 的作用的作用：：

溶解核膜和核小体溶解核膜和核小体，，使其解聚使其解聚，，将核酸释放出来释放出来；；

对RNA 、DNA 酶有抑制作用酶有抑制作用；； 与蛋白质形成复合物与蛋白质形成复合物，，使蛋白质变性使蛋白质变性。。

蛋白酶K ：

水解蛋白质的作用水解蛋白质的作用，，消化DNA 酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质。。

酚可以使蛋白质变性沉淀酚可以使蛋白质变性沉淀、、抑制DNA 酶活性酶活性。。 PH 8.0的Tris 溶液可以使得抽提出的DNA 进入

水相水相，，减少在蛋白质层滞留减少在蛋白质层滞留。。

在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇氯仿中加入少许的异戊醇，，是可以

苯酚在空气中经常被氧化生成醌苯酚在空气中经常被氧化生成醌，，它能够产生自由基自由基，，如果直接用于DNA 分离分离，，会使磷酸二酯键断裂酯键断裂，，造成DNA 降解降解。。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物高温重蒸以除去氧化物，，并用Tris -Hcl 饱和

细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相度的甲酰胺裂解DNA 与蛋白质的复合物（即染色质即染色质），），），然后通过火棉胶袋然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。。

3. 玻棒缠绕法

以盐酸胍裂解细胞以盐酸胍裂解细胞，，制备的DNA 分子量只有大约80kb ，其长度不适用于构建杂交和PCR 反应都可以获得很好的结果反应都可以获得很好的结果。。 该法简单快速该法简单快速，，可同时提取多个样品可同时提取多个样品。。

白质白质，，并失活DNA 酶，酚氯仿抽提去除蛋白质后白质后，，用2倍容积的异丙醇来沉淀含0.1mol/L NaCl 的DNA 溶液溶液，，DNA 沉淀是丝状淀是丝状，，而RNA 在异丙醇溶液中仍为可RNA ，省去了加RNA 酶消化RNA 的步骤。

（三）质粒DNA的分离纯化

质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA 分子分子。。

其大小范围从lkb 至200kb 以上不等以上不等，，已经在形形色色的细菌类群中发现质粒形色色的细菌类群中发现质粒，，这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位性遗传单位。。

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物达的重要媒介物，，这种基因运载工具在基粒的分离与提取则是最常用粒的分离与提取则是最常用、、最基本的实验技术验技术。。

选择哪种方法制备质粒DNA ，应考虑以下因素应考虑以下因素：：

1．菌株类型

4．细菌的培养与收集