影响原生质体培养的因素一

前言
• 植物原生质体的概念
• 植物原生质体融合的涵义 • 植物原生质体融合的发展
植物原生质体的概念
• 原生质体就是除去了细胞壁的裸露的球形 细胞。 • 原生质体具有一切活细胞的特性，同时具 有许多细胞完整细胞不具备的特点。这些 特点和植物细胞全能性结合起来，使植物 原生质体在遗传工程和体细胞遗传学中开 辟了一个理论和应用研究的崭新领域。
drop technique)
影响原生质体培养的因素
• • • • • （一）原生质体活力测定 （二）培养时的密度 （三）培养基 （四）光照：最初两周暗培养；分化时补充光照培养 （五）温度：随培养物的种类而不同。
16.2 植物原生质体融合
• 根据融合时细胞的完整程度，原生质体融 合可分为两大类： • 对称融合（asymmetric fusion） －即两个完整的细胞原生质体融合。 • 非对称融合（symmetric fusion） －利用物理或化学方法使某亲本的核或细 胞质失活后再进行融合
产生的融合没有特异性，可以使动物-动物、动物-植物以及 植物-植物的原生质体发生融合。
对PEG融合效果的影响因子：
• • • • • PEG浓度：25-30% PEG的分子量：1500-6000 钙离子浓度：50m mol/l， 作用时间：15-30分钟 原生质体的浓度：4~5%的原生质体的悬浮 液（原生质体的容积/液体容积）。
4）酶液的pH值：
• 取决于植物材料，一般在5.4-6.0；
• pH值低，酶活性强，分离快，wk.baidu.com易于损害
细胞，原生质体产率低；
• pH值高，酶活性弱，分离慢，但不易损害 细胞，原生质体产率高；
植物材料的生理状态：
• 如株龄、发育状态、栽培条件等对取材影响很大；
• 一般选取体细胞分裂旺盛的材料； • 选取愈伤组织或胚状体效果更好。
16.2.1原生质体融合技术
• 原生质体可以自发地发生融合，但融合频
率极低，在体细胞杂交中没有意义。 • 在体细胞杂交中，通常都是采用物理的和 化学的方法人工诱导产生融合
（一）化学诱导融合的方法和机制
• 1、盐类融合法
• Carlson等（1972）利用这种方法产生了第一个体细胞杂种。
• 优点：盐类融合剂对原生质体破坏小。 • 缺点：融合的频率低、异核体的频率低。 对液泡化发达的原生质体不易诱发融合
4）梯度离心法
• A：6%的聚蔗糖和9%的聚蔗糖（溶于其他 盐类和7%山梨醇中），组成梯度离心液， 经150g离心5分钟。细胞残片留于管底，原 生质体上浮。
• B：400g 离心5分钟，在蔗糖层之上出现纯 净的原生质体层，碎屑在管底。
16.1.4原生质体鉴定与活力测定
• （1）原生质体鉴定：判断是否真正为原生质体。 • 两种主要方法： • 低渗爆破法：显微镜观察，原生质体胀破后则 无残迹。 • 荧光染色法：原生质体放入离心管→加入 0.7mol/L甘露醇配制的0.05%~0.1%荧光增白剂溶 液，染色5~10min→离心洗涤除去多余染料→荧光 显微镜360~440nm→绿色荧光显示纤维素的存在， 红色光为无纤维素的原生质体。
• （2）活力测定
• 染色法：二乙酸荧光素(FDA)法，活力原生质体发荧光。
• 酚藏花红染料法：活力原生质体吸收染料显红色，无活力 者不吸收染料显白色。 • 伊文思蓝染色法：有活力者不吸收染料为无色，无活力者 吸收染料显蓝色。 • 胞质环流法：显微观察。 • 渗透压变化：体积不变者为已死亡原生质体。 • 氧电极法：有活力者光照下会进行光合作用而放氧，无光 照下进行呼吸而耗氧。
2）渗透压稳定剂：
• 渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质
体免于膨胀破裂，而且还有助于酶和底物的结合， 原生质体从组织中加快释放。 • 常用的如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类 （KCl, MgSO4.7H2O)等；
3）质膜稳定剂：
• 增加对质膜的稳定性；促进原生质体细胞
壁再生以及细胞分裂。 • 如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾、 MES( 2-N-吗啉乙烷磺酸)等
• 常用盐类：硝酸盐类；氯化物；葡聚糖硫酸盐
2、高钙高pH值法
• Keller和Melchers（1973）利用强碱性 （pH10.5）的高浓度钙离子 （50mmol/LCaCl2.2H2O）溶液在37℃，处理 30分钟诱导了两个烟草品系叶肉细胞的原生质体 发生了融合。 • Ca2+浓度 0.05 mol/L；
• 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。
原生质体材料来源
★ 植物叶片
－取材容易 －比较容易用酶解法分离
★ 植物根尖组织
－可由各种植物的种子萌发后取得
★ 植物花粉
－产生单倍体原生质体
★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞
－细胞壁容易解离
16.1植物原生质体的制备
• 16.1.1植物原生质体的分离
4 PEG高钙高pH值法
• 利用强碱性高浓度钙离子溶液清洗PEG，引起原生质体表面电 荷紊乱并重排，促进细胞融合。
• 操作过程： • 1)收集两种亲本原生质体，高密度等体 积混合； • 2)混悬液滴3滴于载玻片，放置10min， 加PEG溶液450μL; • 3)静置10～20min，加0.5mL高pH、高 Ca2+溶液，10min后再加1次； • 4)10min后加1mL原生质体培养基洗涤5次， 间隔5min/次； • 5)最后加入300～500μL原生质体培养基， 微滴培养。
16.1.4 原生质体的培养方法
• • • • • （一）液体培养法 （二）固体平板培养法 （三）双层培养法 （四）看护培养法 （五）悬滴培养法
（一）液体培养法
• 1、液体浅层培养 • 将原生质体悬浮于液体培养基中，在培养皿或培 养瓶中培养，液层厚度1mm。 • 2、液体小滴法培养 • 将原生质体悬浮于液体培养基中，用吸管吸取原 生质体的悬浮液，滴于6cm直径的培养皿中培养， 液滴大小在 0.1-0.2ml左右 。 • 优点：培养方便，利于补充新鲜培养基，利于培 养物的转移和分离。
刚游离出来的叶肉原生质体
16.1.3 植物原生质体的纯化
• 酶解后的混合物中将含有完整的原生质体、 亚细胞碎屑（叶绿体、维管成分）、未被消 化的细胞等，因而必须将这些杂质除去。
• 初步筛选：利用50-70µm孔径的镍丝网过滤 混合物，收集滤出液，做进一步的纯化。
1）过滤法
利用孔径更小的镍丝网过滤最初的滤出液
• 饲养层培养具体方法：四种 • 饲养细胞与原生质体共同混合于琼脂 培养基中； • 两者分别混于琼脂培养基，前者位于 下层，后者位于上层； • 两者一起混于液体培养基培养； • 双层滤纸培养植板培养。
• (5) 悬浮培养法(cell suspension culture)与悬滴培养法(hanging
– －优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破 坏作用。 – －缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。
★ 酶解分离法
– 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶类（纤维 素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果 胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、 蜗牛酶和胼胝质酶。 – 优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎 所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶 解法获得原生质体。 – 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过 氧化物酶以及酚类物质。影响所获原生质体的 活力。
（二）固体平板培养法
• 将原生质体接种于固体培养基中，在培养
皿或培养瓶中培养，培养基厚度1mm。
• 优点：原生质体的位置固定不变，为定点
跟踪观察原生质体的发育过程提供了方便。
固体平板培养
（三）双层培养法
• 在培养皿的底部为固体培养基，在固体培
养基上滴加原生质体悬浮液。 • 优点：固体培养基能够不断地补充液体培 养基中的营养，液体培养基不易干枯。
• (四)看守培养与饲养层培养法： • 看守培养(nurse culture)：指用一块活跃 生长的愈伤组织来看守单个原生质体或细 胞，使其持续分裂和增值的一种培养方法。 优点是简便、成功率高。 • 饲养层培养(nutritive/feeder layer culture)： 是指用处理（如X射线）过的无活性的或分 裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲 养所需培养的原生质体或细胞，使其分裂 和生长的培养方法。
• 16.1.2植物原生质体的制备影响 • 16.1.3植物原生质体的纯化 • 16.1.4植物原生质体的培养方法
16.1.1植物原生质体的分离
•常用的分离方法 •机械分离法 •酶解分离法
★ 机械分离法
• －先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细 胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球 形式，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可 以释放出完整的原生质体。
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
• 学习目的：了解植物原生质体的制备和
融合技术，了解杂种细胞的筛选和鉴定
方法。 • 重点：植物原生质体的制备和融合技术 • 难点：植物杂种细胞筛选
内容
• • • • • • 前言 16.1植物原生质体制备 16.2植物原生质体融合 16.3植物杂种细胞筛选 16.4植物杂种细胞鉴定 16.5植物体细胞融合意义
纯化后的叶肉原生质体
植物原生质体融合
• 原生质体融合(protoplast fusion)：指通过 物理或化学方法，使遗传性状不同的两个 细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有 双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
• 还包括融合后的重组细胞分化再生形成新 物种的技术过程。
植物细胞杂交的几个重要进展
• 1960年，Cocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；
• 1970年，Power首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生 质体诱导融合；
• 1971年，Nagata和Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生 完整植株； • 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是 第一个植物细胞杂种； • 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相 应的融合技术； • 1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； • 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；
• pH 9.5-10.5
• 融合容易； • 但对于有些原生质体体系来说，如此 高的pH值也许是有害的。
3，聚乙二醇（PEG）法,
• 是目前原生质体融合的主流技术
• 聚乙二醇分子式为HOCH2（CH2-O-CH2）nCH2OH，水溶性
• 融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子 和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成 静电键，在原生质体之间形成分子桥，促使异源的 原生质体间的粘着结合。 • 优点：融合频率高，异核体频率高，重复性强，毒性低，
原生质体的分离步骤
• • • • • • • （一）取材（叶肉细胞） 充分展开的嫩叶。 洗涤、消毒、无菌水冲洗。 对禾本科植物叶片消毒时，使用苄烷铵（Zephiran） （0.1%） - 酒精（10%）溶液漂洗5分钟效果最好。 （二）酶解 原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和 浓度。 纤维素酶主要分解细胞壁纤维素。 果胶酶主要降解细胞壁间的中胶层。 有些组织在制备原生质体时，可能还会需要半纤维素酶。 离析酶是一种工程酶，可把植物组织分离成单细胞, 与纤 维素酶配合使用制备高等植物原生质体 。
进行纯化。
2）离心沉降法
• 将上述滤出液置于离心管中，在70g100g下离心2-3分钟，原生质体将沉于管
底，细胞碎屑浮于上清液中。
• 弃上清，冲洗液冲洗，50g下离心3-5分 钟。
3）漂浮法
• 利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液做离 心液，将经过镍网初筛的过滤液置于蔗糖溶 液的顶部，在100g下离心10分钟，离心后， 碎屑沉淀，纯净的原生质体将出现在蔗糖溶 液和原生质体冲洗液的界面上。 • 利用移液管将原生质体吸出，转移到另一个 离心管中，用冲洗液冲洗3次。 • 离心液的蔗糖浓度为20-21%。
• • • •
16.1.2影响原生质体数量和活力的因素
• • • • • • 1）材料特性与降解酶： 2）渗透压稳定剂： 3）质膜稳定剂： 4）酶液的pH值： 5）温度因子 25-27 ℃ 6）植物材料的生理状态：如株龄、发育状 态、栽培条件等对取材影响很大；
1）材料特性与降解酶：
• 不同种类植物或不同组织和细胞，其细胞 壁的组成和结构有差异； • 植物的细胞壁特性决定了分离原生质体所 用的降解酶种类与组合