HPLC和LC_MS_MS鉴定锁阳固精丸中非法添加的西地那非衍生物

HPLC和LC-MS/MS鉴定锁阳固精丸中非法添加的西地那非衍生物

向智敏1，张骊2，祝明1，郑成1(1. 浙江省药品检验所，杭州 310004；2. 浙江工商大学食品与生物工程学院，杭州 310035)

摘要：目的鉴定中成药中非法掺入的西地那非衍生物。方法采用高效液相色谱-二极管阵列检测器法(HPLC-DAD)和液相色谱-电喷雾电离-质谱联用法(LC-ESI-MS/MS)，定性分析锁阳固精丸中非法掺入的西地那非衍生物。结果通过比较被测样品成分和西地那非对照品的紫外吸收光谱图，并对两者的质谱碎片数据进行解析和研究，确认西地那非的一种衍生物羟甲基西地那非(hydroxyhomosildenafil)。结论利用液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)，结合质谱分子结构解析技术，具有专属性强的特点，可以准确分析中成药中非法添加的西地那非衍生物。

关键词：西地那非衍生物；羟甲基西地那非；液相色谱-质谱-质谱法

中图分类号：R917.101 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2010)02-0167-05

Identification of Sildenafil Analog Illegally Added in Dietary Supplement using HPLC and LC-MS/MS

XIANG Zhimin1，ZHANG Li2，ZHU Ming1，ZHENG Cheng 1(1.Zhejiang Institute for Drug Control, Hangzhou 310004, China; 2.Biotechnology & Environmental Engineering, College of Food Science, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To establish a method based on mass spectrometry structural assignments for identification of sildenafil analog added illegally in herbal product. METHODS A high-performance liquid chromatography-diode array detection (HPLC-DAD) method and a liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) method were applied. RESULTS Identification of hydroxyhomosildenafil, an analog of sildenafil was achieved by comparing UV spectrum and mass fragmentation results of the samples with those of sildenafil. Three batches of Suoyang Gujing Wan, a dietary supplement, were found containing hydroxyhomosildenafil. CONCLUSION Based on structural assignments of mass fragments, analog of sildenafil could be rapidly and accurately determined in herbal product.

KEY WORDS: sildenafil analog; hydroxyhomosildenafil; LC-MS/MS

西地那非(sildenafil，商品名为万艾可)是一种5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂，已被批准为用于治疗男性勃起功能障碍(ED)的处方药物，具有一定的不良反应，需在医生指导下使用。近年来部分厂家在一些补肾或暗示具有壮阳功能的非处方中药或保健食品中非法掺入西地那非等ED治疗化学药物，严重违反药品管理法，危及患者的安全，因此药品监督检验部门专门开展了对涉嫌非法添加ED治疗药品的监督检验。但目前市场上已出现了对ED治疗药物分子进行化学修饰、改变部分官能团而得到的化学衍生物，这些衍生物仍有ED治疗的功效、但分子量和分子结构与原药物不同。这些衍生物未经国家药品监督管理部门批准，缺乏药理和毒性试验数据，不良反应不明确，服用后的不良反应难以预料。添加这些衍生物的药品或保健食品，用已有检测方法不能确定，有的销售者在网上称此为检测不出来的产品。因此有些厂家已由原来添加ED药物改为添加ED药物衍生物，以逃避药品监督检验。由于这些衍生物是未经批准而合成生产的、目前还不能得到对照品，针对目前的实际情况，因此要求建立无对照品也能准确进行定性鉴定的检验方法。

质谱法是进行有机分子结构鉴定研究的有效方法。邢杰等[1]对合成的分子量分别为391，446，460，474的4种西地那非衍生物进行了电喷雾离子阱质谱的分子结构解析研究；Zou等[2]以HPLC和LC-MS /MS对7种食品补充品中的hydroxyhomosidenafil, homosidenafil, acetildenafil等3种西地那非衍生物进行了测定，衍生物的分子结构以1H-NMR和13C- NMR图谱与文献报导的图谱比较而进行确认。尽管目前国内对中药和保健食品中的西地那非进行分析测定的报道很多[3-7]，但还未见对西地那非衍生物的检测报道。本试验的HPLC和LC-MS/MS，通过对西地那非对照品和被测物的UV吸收光谱的比较和两者的质谱数据解析，在一种名为锁阳固精丸(共3个批号)的中成药样品中检测出一种分

子量为504的化学成分，并确定其为西地那非的一种衍生物hydroxyhomosidenafil 。 1 仪器、试剂和样品

Agilent 1100高效液相色谱仪，带DAD 检测器(美国Agilent 公司)；Surveyor 高效液相色谱仪-TSQ Quantum Discovery 三重四极杆质谱仪(美国Thermo Finnigan 公司)。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，乙酸铵、甲醇、磷酸为分析纯，水是高纯水。枸橼酸西地那非对照品(中国药品生物制品检定所)。锁阳固精丸3批(嘉兴市食品药品监督管理局，批号：2005/10/18，20040201-2，2005/05/18)。 2 对照品和供试品溶液的制备 2.1 对照品溶液的制备

取枸橼酸西地那非对照品适量，加甲醇溶解，制成每1 mL 约含0.2 mg 的溶液，供HPLC 测定；取此溶液加甲醇稀释100倍，供LC-MS/MS 测定。 2.2 供试品溶液的制备

取一次服用量的样品，研成粉末，置25 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min ，放冷至室温，加甲醇至刻度，离心，取上清液供HPLC 测定；取此溶液加甲醇稀释100倍，供LC-MS/MS 测定。 3 实验方法 3.1 HPLC 分析

3.1.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C 18柱(

4.6 mm ×250mm ，5 µm)；柱温为30 ℃；流动相为甲醇-水(70∶30)；检测波长为290 nm 。

3.1.2 HPLC 分析结果 在上述色谱条件下，西地那非的保留时间为5.0 min ，而供试品色谱图中在

4.9 min 也有一个大峰，且两者的DAD 光谱图非常相似，见图1~4，表明两者的分子结构可能非常相似。

图1 西地那非的HPLC 色谱图(tr=5.0 min)

Fig 1 HPLC chromatogram of sildenafil(tr=5.0 min)

3.2 LC-MS/MS 分析

3.2.1 色谱条件 色谱柱为Alltima C 18(2.1 mm ×100 mm ，5 µm)；流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液(55∶45)；柱温为30 ℃；流速为0.2 mL·min −1

。

图2 西地那非的UV 光谱图 Fig 2 UV spectrum of sildenafil

图3 供试品的HPLC 色谱图(tr=4.9 min)

Fig 3 HPLC chromatogram of Suoyang Gujing Wan (tr= 4.9 min)

图4 供试品主峰的UV 光谱图

Fig 4 UV spectrum of a compound found in Suoyang Gujing Wan

3.2.2 质谱条件 电喷雾离子源，正离子检测，离子源电压3 000 V ， 鞘气25单位，辅助气10单位，毛细管温度300 ℃。进样量为5 µL 。采用二级MS 分析。轰击电压为35，45，55 eV 。 3.2.3 质谱测定结果 经LC-MS/MS 测定，西地那非(MW=474)分子离子信号的m/e=475(M+1)，但在同样的条件下(母离子的m/e=475)测定样品时，总离子流图中无色谱峰，表明用HPLC 检出的色谱峰尽管其保留时间和DAD 光谱图与西地那非很接近，但分子量与西地那非不同，不是西地那非。经进一步分析，发现此化合物的MW ＝504，比西地那非大30。两者的二级质谱图见图5、6。

3.2.4 质谱图解析 西地那非和羟甲基西地那非的分子结构见图7。

根据图5和图6的质谱图数据，经Mass Frontier 软件解析得到的结果见图8~10。其中图8为在西地那非和样品主峰的二级质谱图中同时出现的主要离子碎片，图9为仅在西地那非质谱图中出现的碎片，图10为仅在样品质谱图中出现的碎片。