流式细胞仪及其临床应用

流式细胞术及其临床应用

ABSTRACT

Key words: Flowcytometry; Immunophenotyping; Leukemia; Activated platelets; Tumor; Apoptosis.

流式细胞术(flowcytometry FCM)是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析和分选的一门技术。在分析或分选过程中，包绕在流动液体中处理过的单个细胞或微粒通过聚焦的光源，产生电信号，这些信号代表光散射、荧光等参数，以此测定出细胞或微粒的物理和化学性质，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，以对其进一步的培养或分析。包绕细胞的液流称为鞘液。所用仪器称为流式细胞仪（flowcytometer FCM）。流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光技术和计算机科学等多门学科和技术，具有检测速度快、精确、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。

一、流式细胞仪(flowcytometer FCM)

1．流式细胞仪的基本结构

流式细胞仪的结构一般可分四部分，见图1。

（1）流动系统

流动系统是流式细胞仪的心脏，因为细胞悬液在被检测之前必须首先形成一个很细的稳流，细胞在其内部排成单列通过测量区。细胞悬液和鞘液分别（是分别还是同时）进入流动室，鞘液的作用是使样品悬液中的粒子组成单一纵列方式通过测量区，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。

（2）激光系统

多采用氩离子激光器。使发射光在可见光谱范围内488nm激发。目前市场上大多数荧光色素适用于此波长。激光的单色性好，功率高，稳定。

（3）光学和电子系统

激光束射至经流体力学聚焦的个别细胞和粒子后，光散射在各个方向(360?)发射。有两个光散射参数需收集，前向角散射(FSC)主要用于检测细胞体积的大小。另一为侧向散射(SSC)用于检测细胞膜，胞质，核膜等细胞内部结构及胞质内颗粒。

荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的。荧光波长与激光波长不同，而且强度较弱，因此要使用光学滤片滤除非荧光信号并使用灵敏的检测器。荧光测量时通常使用线性放大器（即放大器的输出与输入是线性关系），适用于较小范围内变化的信号，如前向角散射和DNA测量。但有时需要对数放大器（即输出与输入是对数关系）。如果原来输出为1，当输入增加到原来的10倍时，输出是2。在免疫学检测中常使用对数放大器，因为在免疫学的样品中，可能有的细胞未被染色而仅有自发荧光，为阴性群体；被染上色的细胞特异性荧光可能比自发荧光强数倍到数十倍，为阳性群体。使用对数放大器可以同时分辨出亮度差异大的多个细胞亚群，容易选定不同亚群间的分界点，有利于流式细胞仪的分析和分选。

荧光信号的补偿：当用一种激光束同时激发两种染料发射出两种不同波长的荧光时，两种荧光发射光谱有一定的重迭，可用电补偿减去不适合荧光通道测定的重迭信号。

（4）数据贮存和计算机控制系统

数据贮存采用列表排队(List Mode)方式。利用计算机用多种图形来表明各参数间的相互关系，以单参数直方图，双参数二维点图，等高图等方式显示。数据分析一般设定正确的分析范围，划分计算区域和计算结果。

细胞分选可使被指定的细胞从细胞群体中分离出来。流式细胞仪所测定的任何参数都可以作为细胞分选依据，被选出来的细胞的均一性与所测参数有关。其工作原理是把液滴形成信号在压电晶体上使之产生机械振动（不太通顺），液柱断裂成一连串均匀的液滴，一部分液滴中包有细胞，如果其特性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则带有特定的电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，偏转落入指定的收集器内，完成细胞分类收集的目的。

2．流式细胞仪的类型

流式细胞仪分为两大类，一类为临床分析型(又名台式机)，特点为仪器光路调节系统固定，自动化程度高，易学易掌握。如Becton Dickinson(简称BD)公司的FACSCalibur、Beckman-Coulter公司的EPICSXL、Cytomation公司的MOFLO、Partec公司的Pas、Aber 公司的Microcyte、Ortho公司Cytoron等；另一类为科研(分选)型，特点为可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并且将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于更广泛的科学研究之用。如BD公司的FACS Vantage，Beckman Coulter公司的EPICSALTRA，Cytomation公司的MOFLOMLS及Partec公司的Pas-III等。最近BD公司推出了FACSAria,其优点为具备科研分选型标准而操作与临床分析型同样简便，自动化程度高。

3．流式细胞仪检测的质量控制

（1）样品与试剂

血液、骨髓、体液等必须当天采集，6 h之内进行免疫荧光染色；活化血小板检测应在采血后立即染色与固定。组织样品可采用机械法去聚集并过滤，最好用单细胞制备仪（medimachine）处理。试剂、缓冲液、溶血剂、固定剂等必须符合标准。

（2）对照设置

目的是避免各种因素可能造成的假阳性或假阴性反应。

①同型对照：与单克隆抗体（MoAb）相同的、未免疫小鼠标记荧光素的免疫球蛋白亚类作对照。主要考虑细胞的自发荧光、非特异性抗体结合等影响因素。

②阳性对照：已知阳性标本能否确定为阳性。达不到要求时不能进行临床试验。

③阴性对照：用已知不表达某种抗原的细胞作样品检测，应出现阴性。目的是避免实验的非特异性反应。

④正常对照：对一种新的MoAb，在使用前进行对照试验，可保证仪器在最佳条件下获取样品。

⑤质控品：

试剂厂方提供与待测样品成分相近的稳定的质控物，并提供检测项目的靶值和质控范围，作为某一试验项目的全程质量检测物，评估试验结果的可靠性。如BDMulti-Check Control 是淋巴细胞及其亚群分析的全血质控品。

（3）仪器的校准与性能检测

使用标准荧光微球，运行FACSComp软件，校准通过，表明仪器状况良好。

二、流式细胞仪的功能和临床应用

流式细胞仪最大的贡献在于促进了免疫学基础研究和临床诊断。目前流式细胞术已被广泛用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、病理学、遗传学和临床检验等多学科领域的基础和临床研究。

1．流式细胞仪的功能