南开大学分子生物物理-蛋白质的折叠

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如果一级结构是肽链折叠形成功能蛋白质的特定三维 结构的内因是第一要素；那么帮助蛋白质肽链正确折 叠的外因是条件，外因要通过内因起作用；但如果没 有适当的充分的条件，多肽链也不能折叠成为活性蛋 白质。
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蛋白质折叠的研究内容

蛋白质折叠的研究，狭义的定义就是研究蛋白质特定
三维空间结构形成的规律、稳定性及与其生物活性的

后来，有人把这设想的一级结构决定空间结构的密码叫作 “第二遗传密码”。因此，研究蛋白质折叠的过程，可以
说是破译“第二遗传密码”——折叠密码（folding code）
的过程。
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§2.2 蛋白质折叠的热力学考虑
变性：蛋白质受到某些物理因素如热、紫外照射、高压和 表面张力等或化学因素如有机溶剂、脲、盐酸胍、酸、碱 等的影响，会发生蛋白质的变性。变性作用不涉及共价键 的断裂，蛋白质的一级结构保持完好，但高级结构被破坏， 天然构象解体。 蛋白质变性的的化学本质：维持高级结构的次级键（氢键， 离子键，疏水相互作用，范德华力等）被破坏（一级结构 不被破坏），特别是氢键的破坏，从而具有活性的蛋白质 空间构象被破坏。 有些蛋白质的变性是可逆的。 将变性因素除去后，变性蛋白质可以恢复其天然构象，这 个过程称为蛋白质的复性（renaturation）。
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同时代取得的其它一些结果
• •
折叠是以结构域为单位进行的。
Ribonuclease A 去除 5 C-末端残基后，蛋白质就丧失了 正确形成二硫键的能力。 (H. Taniuchi, J. Biol. Chem. 245, 5459-5468; 1970) 含有两个或多个结构域的蛋白质，相邻结构域的解折叠 是近似相互独立的。
3. pH~8弱碱性条件，溶液暴露于空气中， 重新氧化复性，酶活力重新获得。
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-巯基乙醇
一种有机化合物，其化学式为HOCH2CH2SH，英文通用缩写为ME或βME。 它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能团， 为挥发性液体，具有较强烈的刺激性气味。βME通常用于二硫键的还原， 可以作为生物学实验中的抗氧化剂。由于β-巯基乙醇能够打开蛋白质的结 构，它常常被用于蛋白质分析。此外，β-巯基乙醇也常常被用于保护蛋白 质中自由的半胱氨酸巯基之间不会错误形成二硫键。

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折叠 变性
去折叠 复性
in vivo: 新生肽的折叠 in vitro: 变性（去折叠）蛋白的复性（重折叠）
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变性后高级结构破坏，一级结构不变
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变性条件
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1. 2. 3. 有机溶剂 4.

脲 盐酸胍 去垢剂
温度 pH 盐 变性剂
尿素：碳酸(全)酰胺O=C(NH2)2 8M 胍：HN=C(NH2)2 6M
2、蛋白质的跨膜运输
3、蛋白质的水解和更新
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小分子蛋白质去折叠转变是可逆的。在周围
环境的诱导下，小分子蛋白质发生去折叠，
当将环境刺激因素去掉后，去折叠的蛋白质 又可以再折叠。
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Anfinsen的经典热力学假说：
Anfinsen认为天然蛋白质多肽链所采取的构象 是在一定环境条件下（如溶液组分、pH、温度、 离子强度等），整个系统的总Gibbs自由能取最低， 所以处于变性状态的多肽链能够在这样的环境下自 发折叠成天然构象。
遗传信息的传递应该是从核苷酸序列到有完整结构的功能 蛋白质的全过程。
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§2.1 蛋白质折叠的基本概念和研究概况
定义：蛋白质折叠是多肽链凭借相互作用在细胞环
境（特定的酸碱度、温度等）下自己组装自己，从
无规卷曲（去折叠态）折叠到三维功能结构（天然 态）的物理过程。
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DNA
RNA
蛋白质（新生肽链）
根据蛋白质的氨基酸序列预测其相应的“唯一”的三维结构，
那么，如何由一级结构预测三级结构？
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近年来的研究表明蛋白质折叠是一个序变过程，可通过捕捉蛋
白质折叠的中间状态了解蛋白质折叠的全过程。 在研究牛与人的α －乳清蛋白酸变性、热变性和在中等浓度盐

酸胍溶液中变性时的各种物理性质，发现在这些条件下都能形
成一种彼此类似但又不同于天然分子的结构，具有与天然蛋白 不同的新的物理状态—“熔球态”。

熔球态是蛋白质折叠过程的中间态，与天然分子比较，虽然被
动性增加，不存在特定的牢固安排的侧链基团，但其结构仍是 紧密的，并且具有显著的分子柔性，二级结构含量很高。

对大多数小分子量蛋白质来说，变性的蛋白质在没有外力的情

力学上稳定的三维结构的必然，但是没有阐明蛋白质折叠的全
过程，还有些问题需要回答：一级结构到底如何决定高级结构？ 具有完整一级结构的多肽链又如何克服在动力学上可能的能障，
最终达到这个热力学上最稳定的状态？是否存在像三联遗传密
码那样的第二套密码，即氨基酸序列决定蛋白质的三维结构的 所谓的“折叠密码” ？按照Anfinsen原理，在理论上应该可以

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Anfinsen 对 Ribonuclease 的研究提出了蛋白质一级结 构决定高级结构的假说。 Anfinsen's work, 1957-63: formation of native disulfide bonds in ribonuclease A and other proteins.
Anfinsen实验
1. 由实验一可知，模型 2 不成立，因为离体条 件下复性的蛋白具有全部酶活性（后来又有实 验证明体外解折叠是完全的，全人工合成）。 2. 由实验二可知，模型 1 不成立，否则，复性 的蛋白应该具有几乎全部酶活性。 3. 模型 3 能够解释 both 结果。 结论：蛋白质一级结构决定三级结构 形成三级结构所需要的所有信息包含在一级结构中。
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Anfinsen实验
变性蛋白的复性实验

从二硫键入手，提出假设，实验验证其正确性 材料: 牛胰核糖核酸酶 含4对二硫键 26-84 40-95 58-110 65-72
-S-S-交联方式: 7x5x3x1=105种，天然只占其中一种
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牛胰核糖核酸酶的一级结构
二 硫 键
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Anfinsen实验
关系。

在概念上有热力学的问题和动力学的问题；


有在体外折叠和在细胞内折叠的问题；
有理论研究和实验研究的问题。
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最根本的科学问题就是多肽链的一级结构到底如何决定它
的空间结构？

既然前者决定后者，一级结构和空间结构之间肯定存在某 种确定的关系，这是否也像核苷酸通过“三联密码”决定
氨基酸顺序那样有一套密码呢？
Key discovery: the information needed for folding is contained in the amino acid sequence.
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这些经典的工作开辟了近代蛋白质折叠的研究，形成了蛋白质
折叠自组装（self－assembly）的主导学说。 Anfinsen 原理揭示了蛋白质的氨基酸序列决定蛋白质分子在热
分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。
从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其 功能，是极富挑战性的工作。研究蛋白质折叠，尤其是 折叠早期过程，即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐 明中心法则的一个根本问题。
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DNA 遗传信息的传递 多肽链
RNA
Proteins 实质上是多肽链
有活性的蛋白质 天然构象
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过量巯基乙醇 导致还原
脲变性
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错配的二 硫键只需 要加一点 点巯基乙 醇就可复 性
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Anfinsen实验
实验二 1. 同上。Ribonuclease + 8M脲 + -巯基乙醇， 脲使得肽链展开，酶失活；
2. 透析除巯基乙醇，然后通O2，再透析除脲。 结果：酶活性恢复到~0.01
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况下可以通过折叠达到天然状态。
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体内蛋白质的折叠往往需要有其他辅助因子的参与，并伴 随有ATP的水解。因此，Ellis 于1987年提出了蛋白质折叠 的“辅助性组装学说”。这表明蛋白质的折叠不仅仅是一 个热力学的过程，显然也受到动力学的控制。

“辅助性组装学说”认为，蛋白质多肽链的正确折叠和组 装并非都能自发完成，在相当多的情况下是需要其他蛋白 质分子的帮助，这类帮助蛋白包括分子伴侣（molecular chaperone）与折叠酶。新的观点在实质上并不和Anfinsen 理论相矛盾，属于蛋白质折叠途径或折叠的识别和组装问 题上的认识的完善 。
蛋白质的功能
结构功能
运输功能 收缩和运动功能
信号传导和调控功能
催化功能
遗传和发育 防御功能
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蛋 白 质 的 合 成 过 程
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蛋白质的结构表示
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蛋白质通过结构专一性结合实现其功能
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肾上腺素
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第二章 蛋白质的折叠
蛋白质折叠问题是生命科学领域的前沿课题之一， 并且被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是
•
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§2.3 折叠的动力学考虑

有无中间体？
最低自由能构象能否达到？ 折叠过程是怎样的？
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两态折叠
单一结构域的蛋白质，不存在平衡中间态。
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折叠中间态的发现
•
首先在折叠、去折叠的早期动力学时相（快速反应）
中发现。(Cytochrome c: A. Ikai and C. Tanford, Nature 230, 100-102; 1971; ribonuclease A: T. Y. Tsong, R.L. Baldwin and E.L. Elson, PNAS 68, 2712-2715; 1971)
新生肽链必须经历一系列极其复杂的加工过程，包括氨基酸残 基的化学修饰诸如二硫键的形成、糖基化作用、羟基化作用、 磷酸化作用等。现在已知的与翻译同时进行或在翻译完成后进 行的化学修饰反应已经超过100种。 新生肽链必须进行折叠，才能形成一定的三维结构。 每一个新合成的多肽链都必须转运到细胞内特定的场所或者被 分泌到细胞外区发挥作用。这些转运往往需要经过一次甚至多 次的跨膜过程。完全折叠好的蛋白质是不能跨越细胞膜的，因 此如果折叠过早或过多，还要先去折叠，才能跨膜运输到特定 的发挥其生物功能的场所，再最终折叠成为功能蛋白。
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多亚基蛋白还要进行亚基的组装。 许多以前体形式合成的蛋白，如一些蛋白酶等还必须经过水解
除去前体分子中的“前序列”才能转变成具有活性的酶分子。

新生肽只有折叠成特定的三维结构，才能获得特定的生物学功 能，成熟为功能蛋白分子。

新生肽的折叠不仅指肽链在空间的盘卷，而是包括广义的新生 肽链的整个成熟过程，包括化学修饰、跨膜转运、亚基组装、
水解激活等。
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蛋白质折叠研究的概况

20世纪50年代Fraekel和Williams从烟草斑纹病毒分离出外壳蛋 白和核糖核酸，在体外生理条件下重组得到有感染活力的病毒 粒子。 60年代美国生物化学家安芬森（Anfinsen） 根据还原变性的牛 胰核糖核酸酶在去除变性剂和还原剂后，不需要任何其他物质 的帮助，能够自发的形成正确的4对二硫键，重新折叠成天然的 三维结构，并恢复几乎全部生物活性的实验，提出“多肽链的 氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必须的全 部信息”或者说“一级结构决定高级结构”的著名论断，为此 Anfinsen 获得1972年Nobel化学奖。
模型一：空间障碍，只允许一种构象（二硫键配对） 模型二：生物合成的结果
模型三：先形成了热力学稳定构象，然后形成二硫键加固
实验否定了前两种假设，肯定了第三种
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Anfinsen实验
实验一： 1. 脲变性。Ribonuclease + 8M脲 + -巯基乙醇， 脲使得肽链展开，酶失活；
2. 透析除脲和-巯基乙醇；
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Anfinsen实验
Model 1 and 2 都 有实验支 持
Anfinsen实验的启示：
1. 成功需要一点点运气（简单的单结构域蛋白）
2. 抓住主要矛盾，善于洞察问题的本质 3. 严谨的推理不是得到正确结论的必要条件 正确的前提＋正确的推导＝正确的结论 正确的前提＋错误的推导＝正确或错误的结论 错误的前提＋正确的推导＝错误的结论（大概率） 错误的前提＋错误的推导＝正确或错误的结论
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Native Protein Denatured
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变性原理

破坏次级键
不破坏共价键 温度：较高时导致蛋白质交联聚沉，凝固，不可逆 pH ：破坏盐键，影响解离，改变相互作用的性质 盐 ：活度，溶解度 脲 ：竞争氢键
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由于蛋白质的功能决定于它们的天然构象，因而 过去研究工作集中在蛋白质的天然构象上，而对 变性态没有给予足够重视。近来，人们已知道蛋 白质的非天然构象至少在以下三方面有重要作用： 1、蛋白质折叠和稳定性