三种室内饲养鱼类肠道微生物群落PCR_DGGE指纹分析_李学梅

第35卷 第3期

水生生物学报

Vol. 35, No.3 2011年5月

ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA

May, 2 0 1 1

收稿日期: 2010-06-28; 修订日期: 2011-01-19

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(2007CB109205); 国家自然科学基金(30970358)资助

作者简介: 李学梅(1985—), 女, 河北邯郸人; 博士研究生; 主要从事鱼类肠道微生物研究。E-mail: lanqian1985@ 通讯作者: 余育和(1956—), 男, 湖南汨罗人; 研究员; 主要从事原生动物学研究。E-mail: yhyu@

DOI: 10.3724/SP.J.1035.2011.00423

三种室内饲养鱼类肠道微生物群落PCR-DGGE 指纹分析

李学梅1,3

余育和1 解绶启2 颜庆云1 陈宇航2,3 董小林2,3

(1. 中国科学院水生生物研究所, 中国科学院水生生物多样性与保护重点实验室, 武汉430072;

2. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072;

3. 中国科学院研究生院, 北京100049)

摘要: 以室内饲养的斑点叉尾(Ictalurus punctatus )、银鲫和异育银鲫(中科三号)(Carassius auratus gibelio )幼鱼为对象, 通过PCR-DGGE 指纹技术对其肠道微生物群落进行了探索研究。在三种鱼的肠道中检测到不同的PCR-DGGE 指纹谱带, 其中斑点叉尾的平均谱带数(7.5)相对于银鲫和异育银鲫的谱带数(分别为15 和14)要少。基于PCR-DGGE 指纹谱带及各谱带相对丰度的UPGMA 聚类和MDS 排序结果显示银鲫和异育银鲫肠道微生物相似性高, 而与斑点叉尾的差异比较大; rank-abundance 散点图及回归分析也显示斑点叉尾

与银鲫、异育银鲫肠道微生物群落存在显著差异(P <0.05), 而银鲫和异育银鲫之间无显著差异(P = 0.383)。在斑点叉尾肠道中检测到的菌群主要是变形杆菌, 包括γ-变形杆菌和α-变形杆菌; 而银鲫和异育银鲫肠道中菌群主要包括梭杆菌属中的类群, 还包括变形杆菌门中的气单胞菌属, 以及一些未知的类群。以上结果均表明在所研究的三种鱼的幼鱼阶段, 其肠道微生物组成在不同种类鱼中存在差异, 且该差异受基因型的影响可能更大。

关键词: 斑点叉尾; 银鲫; 异育银鲫; PCR-DGGE; 肠道微生物群落

中图分类号: Q145+.2; Q781 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2011)03-0423-07

肠道微生物是一个复杂多样的群体, 同时也是动物体的重要组成部分。鱼类肠道中每克内含物中大约存在108个异养性微生物和105个厌氧细菌, 它们与宿主相互依存并相互影响[1,2]。肠道菌群在鱼类的生长发育过程中担当非常重要的作用, 它既要参与营养物质的消化和吸收, 同时也要担当机体的防御功能, 维护机体健康。Rawls, et al .[3,4]在对斑马鱼肠道菌群进行研究时发现, 肠道菌群能够促进其上皮细胞增殖, 增强营养物种代谢和免疫反应。同样, 鱼类的各种生理生态特征也会对肠道微生物产生影响: 已有研究报道指出不同生长环境下鱼类的肠道细菌群落有明显的差异[5]; 鱼类生长发育会对肠道微生物组成造成影响[6] ; 另外, 鱼类进食的质量和数量也可影响其肠道微生物群落结构[7]。尽管如此,

关于比较不同种类鱼肠道微生物群落结构的报道还较少。不同种类的鱼, 由于其食性、基因等因素, 它们的肠道细菌组成和结构也不尽相同。Ward , et al . [8]在研究两种南极抗冻鱼肠道微生物群落特征时发现: 杂食性的N. coriiceps 肠道微生物的多样性比肉食性的C. aceratus 丰富, 说明同一环境下食性不同的鱼其肠道微生物组成亦不相同。上述研究是以自然环境中的鱼类为研究对象, 那么在同一室内饲养的不同鱼类其肠道微生物群落是否也会存在差异？本研究以室内饲养的斑点叉尾

(Ictalurus punctatus )、普

通银鲫和异育银鲫(中科三号)(Carassius auratus gibelio ) 幼鱼为研究对象, 采用PCR-DGGE 指纹法分析其肠道微生物组成, 旨在比较不同种类鱼在室内养殖条件下肠道微生物群落结构特征, 为进一步

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研究不同肠道细菌的功能提供基础依据。

1材料与方法

1.1样品采集

斑点叉尾、银鲫和异育银鲫(中科三号)饲养于中国科学院水生生物研究所鱼类生理生态学学科组的试验系统中, 每种鱼设有三个重复。三种鱼饲养于同一室内的不同循环系统中, 其水源一致, 且投喂的人工配合饲料成分基本相同。试验期间, 水温在23℃—30℃范围内波动, 每天 9:00和 15:00分别投喂人工配合饲料。30d后, 随机从各组选取3尾同规格的个体(平均约15 g), 饥饿 24h后进行解剖取样。鱼体解剖后取整个肠道, 用70%的酒精棉球擦拭肠外壁后分别取前、中、后三段, 用无菌水冲洗各段肠道并收集洗液到无菌的离心管中。最后将来自同一重复的3尾鱼的洗液混合, 收集好的混合液用于肠道细菌群落总DNA的提取[9]。

1.2肠道微生物群落总DAN提取

向每管混合液中加入1 mL裂解液(0.5% SDS;

10 mmol/L Tris-Cl, pH 8.0; 10 mmol/L EDTA, pH 8.0; 100 mmol/L NaCl; 蛋白酶 K, 100 μg/mL; RNase A, 50 μg/mL), 于55℃水浴裂解12h; 恢复室温后离心取上清液采用常规的酚-氯仿法进行抽提, DNA干燥后重悬于40 µL TE(10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0), 存于 20℃备用。总DNA用0.7%的琼脂糖凝胶(含EB)进行电泳以评估提取效果。

1.3 PCR-DGGE及序列分析

采用针对16S rRNA基因的通用引物(F357-GC 和R518)对9个样品中的肠道细菌进行PCR-DGGE 指纹分析[10-12], 其中变性剂梯度范围为35%—50%。并对PCR-DGGE指纹图谱中的部分条带进行序列分析: 首先将切下的胶条用 50 μL TE于4℃重悬过夜洗脱胶中的 DNA, 离心后取上清 1 μL作模板用不含 GC夹板的上述引物重新进行 PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化。将纯化的 DNA 片段连接到pMD18-T载体中, 克隆后筛选阳性克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序。将所测得的目的序列在NCBI进行BLAST比对, 并从GenBank下载相似物种的16S rRNA基因序列。通过Clustal X程序进行多序列对位排列[13], 经校对和剪切后通过MEGA程序采用NJ法建立系统发育树[14]。

1.4数据分析

PCR- DGGE指纹图谱用Quantity One(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)软件进行分析。不同种类鱼肠道微生物群落结构的相似性通过Dice相似系数来比较, 该系数由公式S=2N AB/(N A + N B)所得, 其中N AB表示两站点的共有谱带数; N A和N B分别代表站点A 和 B 特有的谱带数, 进而针对Dice相似系数进行非加权配对算术平均法聚类(UPGMA)和多维尺度分析(MDS)。不同种类鱼肠道微生物群落结构的差异则是通过rank-abundance散点图来分析, 其中x轴表示每个处理样品中DGGE条带的相对丰度大小的排序, y轴表示DGGE条带的相对丰度(经log10转换)。每个样品对应的线性回归模型则由方程log10y＝a +b x表示, 其中a是截距, b是斜率——群落结构变化的统计描述[15]。UPGMA和MDS由软件XLSTAT-Pro来完成, 线性回归分析由软件SPSS 13.0来完成。

2结果

2.1肠道微生物群落PCR-DGGE指纹分析

针对三种鱼肠道细菌的16S rRNA基因得到相对简单和稳定的DGGE指纹分析图谱(图 1)。由图

图1 16S rDNA变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱

Fig. 1 DGGE patterns of 16S rDNA

L1-L3表示斑点叉尾; L4-L6表示银鲫; L7-L9表示异育银鲫“中科三号”; B1-B14表示测序条带

L1-L3 indicate the samples collected from channel catfish, L4-L6 and L7-L9 from silver prussian carp and hybridized prussian carp, respectively; B1-B14 indicate the bands sequenced