毛细管电泳法-电致化学发光

苏州大学研究生考试答卷封面
考试科目：考试得分：________________ 院别：材料与化学化工学部专业：分析化学
学生姓名：饶海英学号：20114209033
授课教师：
考试日期：2012 年 1 月 6 日
毛细管电泳-电致化学发光联用技术在分析上的应用趋势
摘要：电致化学发光(ECL)方法已经在HPLC和流动注射、免疫分析、DNA探针分析应用，成功用于疾病诊断、临床分析、DNA测序等领域。

近些年，该技术已成功与毛细管电泳(CE)技术联用，显示出快速，高效，灵敏等优点，本文论以ECL-CE联用技术在药物分析方面的研究进行了总结，并且展望了该联用技术的发展前景。

关键词：毛细管电泳分离电致化学发光
毛细管电泳法(CE)作为一种新型微量分离技术, 具有分离效率高、分析速度快、样品消耗量少、装置简单等优点, 已广泛应用于复杂物质分离检测中。

由于其进样量低( nL级) , 因此对检测器的灵敏度有较高的要求。

发展高选择性、高灵敏度的检测技术用于CE成为分析科学的研究热点。

电致化学发光( ECL)是电化学技术和化学发光方法结合在一起的一种高灵敏检测新技术, 具有灵敏、原位、高选择性和高重复性等优点。

将CE与ECL联用, 兼有CE的高分离率及ECL的高灵敏度等特点, 可直接用于样品中微量组分的分离和测定[ 1]。

因此, CE-ECL在药物分析、生物样品分析、环境分析、食品分析等各领域得到了越来越广泛的应用。

1 毛细管电泳-电致化学发光联用技术概述
1.1 CE-ECL技术的原理
电致化学发光或电化学发光( Electrogenerate Chemilumnescence or Electrochemiluminescence ,简称ECL) 是在化学发光基础上发展起来的一种新的分析方法,其基本过程是在电极表面产生电活性物质经历电子转移反应形成激发态，之后激发态能量一光的形式释放出来，利用检测器对光信号进行检测，对物质定性定量的分析。

ECL是化学发光与电化学相互渗透的产物,因此它不但保留了化学发光分析的诸多优点,同时还充分表现出电化学分析的一些特点,是一种可以集成多种技术优势, 综合性很强的技术。

许多试剂能产生电化学发光,但是只有几种类型的电化学发光反应可以在实际中得以应用,按照发光试剂的种类,电化学发光体系可以分为酰肼、吖啶、多环
芳香烃、过氧化草酸酯和金属配合物五类。

这类化合物主要是联吡啶类［M(bpy)32+]化台物如Ru(bpy)32+、Os(bpy)32+、Cr(bpy)32+等。

这类化合物的代表是Ru(bpy)32+，它具有水溶性好，试剂稳定，发光效率高等优点，在测定氨基酸肽、醇类等含氨、含羟基化台物中有广泛的应用。

Ru(bpy)32+的化学发光最早于1966年被Lytle等发现。

毛细管电泳技术是近年发展起来的一项新型分析技术,兼有电泳和色谱技术的双重优点, 以毛细管为分离通道, 以高压直流电场为驱动力, 以样品的多种特性( 电荷大小、等电点、极性、亲和行为、各组分之间淌度、相分配特性等) 为依据的液相分离分析技术。

因而以高效、高速、高灵敏度、高自动化以及样品和试剂耗用量少、成体低、前处理简单、抗污染能力强等一系列优点, 广泛应用于药物研究和分析之中。

CE是以毛细管为分离通道、以高压电场为驱动力, 依据样品中各组分间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类分离技术。

ECL是通过施加一定的电压进行电化学反应, 在电极表面产生一些特殊的物质, 然后这些电生物质之间或电生物质与体系中某些组分之间通过电子传递形成激发态, 由激发态返回到基态或
跃迁到较低能级的另外激发态而产生的一种发光现象。

例如, 二价的联吡啶钌Ru(bpy)32+ ，当正负阶跃脉加于工作电极上时，Ru(bpy)32+被氧化还原: Ru(bpy)32+-e一Ru(bpy)33+氧化
Ru(bpy)32++e一Ru(bpy)3＋还原
Ru(bpy)33+与Ru(bpy)3＋反应形成激发态的Ru(bpy)32+*
Ru(bpy)33++ Ru(bpy)3＋Ru(bpy)32+*电子转移
Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32++hγ(λ＝610 nm) 化学发光
通过电极反应失去一个电子产生Ru(bpy)33+, Ru(bpy)33+与从CE分离出的检测对象反应产生一个自由基, 该自由基与Ru(bpy)33+反应形成激发态发光体。

当激发态发光体返回基态或跃迁到较低能级的另外激发态时, 便发出光子, 作为电泳峰被放大并记录下来。

研究发现发光信号受分析物的电化学发光活性、缓冲溶液的pH等参数影响。

1.2 CE-ECL的模式
CE-ECL主要有四种模式：毛细管区带电泳-ECL(CZE-ECL)，胶束电动色谱
-ECL(MEKC-ECL)，毛细管电色谱-ECL(CEC-ECL)以及非水毛细管电泳
-ECL(NACE-ECL)[2]。

其中CZE-ECL最简单，也最常见。

毛细管区带电泳(CZE)-电化学发光(ECL)CZE是毛细管电泳中最简单的一种模式。

它是通过在充满具有一定缓冲能力的电解质溶液的毛细管柱中，依靠样品中不同荷质比大小的组分在外加电场的作用下迁移速度不同而实现分离。

CZE只能分离带电荷的物质而不能分离中性物质。

但是CZE和ECL联用使得分离和检测产生冲突：Ru(bpy)32+ECL 检测的最佳pH值一般为7.5±1.5，而大多数胺类物质在此pH值范围都是成中性状态，因此CZE在这种情况下不能实现很好的分离；除非在酸性条件下才能实现好的分离，但是在酸性条件下ECL检测灵敏度大大降低。

为了能实现好的分离效果和高灵敏度的检测，近来又出现了以下三种模式：胶束电动色谱(MEKC)-电化学发光(ECL), 毛细管电色谱(CEC)-电化学发光(ECL), 非水毛细管电泳(NACE)-电化学发光(ECL)
2 CE-ECL 技术的发展
CE是20世纪80年代后期迅速发展起来的一项液相分离分析技术, 被誉为20 世纪90年代最重要的分离分析方法之一。

1983年Jongenson等[4]使用75μm内径的熔融石英毛细管做毛细管区带电泳, 以电迁移进样, 结合荧光检测, 在30 kV 电压下产生了4 ×105个N·m-1理论塔板数的空前高分离效率, 从而奠定了现代CE技术的基础。

此后CE技术得到了迅猛的发展, 各种分离模式相继提出, 掀起CE研究的高潮。

CE在生命科学领域中的应用最为广泛, 包括从人类基因组DNA测序到氨基酸、核酸等生物分子的检测等。

近年来CE的应用扩展到药物化学、食品化学、环境化学、毒物学、医学和法医学等领域。

CE中应用较多的检测器有荧光、质谱、电化学、光度法和核磁共振检测器等。

有的仪器昂贵或实际应用范围窄( 如激光诱导荧光检测器) 。

质谱和核磁共振等与CE联用技术, 检测灵敏度很高, 可是, 这些检测器除了价格昂贵之外, 还需要其他比较复杂的配套装置, 操作和维修都不方便。

80 年代的重大发现之一是Ru(bpy)32+的电化学发光。

早在1965年, Kuw ana 等率先开展了鲁米诺的电化学发光机理的研究; 1987 年Noff singer等[5]报道了Ru(bpy)32+烷基胺的ECL, 指出ECL强度与胺本身结构有关。

联吡啶钌的水溶性好, 化学、电化学和光化学性能稳定, 且能在水溶液中进
行ECL反应, 能检测多种物质, 如草酸、氨基酸、烷基胺、环状胺、芳香胺、药物、蛋白质和DNA等。

由于ECL是利用电解技术在电极表面产生某些氧化还原物质而导致的化学发光, 所以它保留了化学发光所具有的灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点; 同时还容易控制、可进行原位( in situ)发光, 一些试剂可以重复使用, 当多种组分同时存在时, 可以施加不同波形、不同电压信号进行选择性测定, 特别是对于使用不稳定氧化物及产生短寿命激发态的化学发光, 更具有灵敏度高的优点。

CE-ECL联用技术最早由Forbes等[5]于1997年提出, 即把CE与Ru(bpy)32+
-ECL结合检测了-受体阻断剂。

在国内, 汪尔康领导的小组最早开展CE-ECL方面的工作, 研制了具有自主知识产权的CE-ECL 仪器, 进行了含氮药物的临床分析、帕金森氏症和痴呆症治疗药物普环啶和本海索等多种药物的分析应用。

他们还利用CE-ECL进行了药物代谢动力学、药物与蛋白质作用等方面的研究。

实践证明, CE-ECL技术作为一种高效、高灵敏的新技术, 在许多领域都体现出了其优势。

3 毛细管电泳-化学发光联用在药物分析中的应用
在毛细管电泳- 化学发光分析中,发光试剂与催化剂以一定的速度混合,得到一定强度的持续光信号,经过电泳毛细管分离的分析物在柱后与发光试剂相遇,对发光强度产生影响,通过光信号的变化对分析物进行检测。

当分析物没有化学发光活性,通常需要对其进行衍生或是采用间接化学发光检测。

何友昭等[ 7 ]采用毛细管电泳- 化学发光联用系统和鲁米诺- 铁氰化钾间接
化学发光法,分离了绿原酸和芸香苷。

对两端电极池作了改进,检出限达到114 ×10 - 5 mol·L - 1 ,比毛细管电泳- 紫外吸收法降低约2个数量级。

李欣欣等[ 8 ]利用儿茶酚胺及儿茶酚淬灭Luminol - K3 Fe (CN) 6体系发光的原理,用毛细管电泳- 化学发光联用技术分离测定了3种儿茶酚胺和儿茶酚。

在最佳条件下测得多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和儿茶酚的检出限分别为0133、118、214和0112μmol·L - 1。

Zhao等[ 9 ]利用喹诺酮类药物可以被Ce ( IV)- SO32-体系在酸性条件下释放的化学能所激发,从而产生弱的化学发光现象,而稀土元素Tb( III)对Ce ( IV)- SO32–发光体系有较强的增敏作用,建立了Tb( III) - Ce ( IV) - 亚硫酸钠化学发光体系检测诺氟沙星和普卢利沙星的方法,检出限分别为517 ×10 - 8 g·mL - 1和814 ×10 -
8g·mL - 1。

Zhao等[ 10 ]利用间羟舒喘宁在碱性条件下对luminol - K3 Fe (CN) 6体系的增敏作用,与毛细管电泳结合测定间羟舒喘宁,检出限达310 ×10 - 8 mol·L - 1。

甘婷婷等[ 11 ]利用贝诺酯的活性代谢物扑热息痛在luminol - K3 Fe (CN) 6发光体系中可与K3 Fe (CN) 6反应,消耗部分K3 Fe (CN) 6 导致体系的发光强度降低这一
性质,采用自组装的无液流脉冲的CE-CL装置,对贝诺酯灌胃后家兔血液中的扑热息痛进行分析,测定了给药一段时间后家兔血浆中扑热息痛的血药浓度,得到了较好的结果。

4 毛细管电泳-电致化学发光技术展望
CE-EC技术作为一种高效、高灵敏分析技术已广泛用于电活性或电化学发光活性物质的分析,对于紫外吸收较弱物质的分析更有特色。

当前, 生命科学、环境科学、药物学等的发展正呈现出一个与应用研究和产业开发越来越紧密的趋势, CE-EC技术将迎合这种发展趋势, 成为推动相关学科和产业发展的力量, 将带来巨大的社会和经济利益。

CE作为一种生化分离技术已经得到较广泛的研究和应用，可以预见将对蛋白质组学研究起很大的促进作用；ECL方法在免疫和DNA 探针分析中的应用说明ECL方法是生物分析领域中很可靠的检测技术。

汪尔康等人将两种分析技术结合，发挥其高效率分离，高灵敏度检测的优点，满足实际分析的需求。

他们已设计研制成ECL仪和CE-ECL仪，并预期可以批量生产，这是发展ECL和CE-ECL的基础。

近年来, CE尤其是在其基础上发展起来的微流控芯片技术, 在临床诊断、重大疾病标识物的筛选与检测方面也获得越来越多的关注。

利用CE-ECL仪，进行含叔胺基团药物的分析,并进一步发展这种技术，结合分子生物学、临床医学、药物学等领域的相关研究，将其应用于临床诊断，重大疾病标识物的筛选与检测。

生命科学的发展当前正呈现一个与应用研究和产业开发越来越紧密的态势，许多研究成果可直接变为具有高利润的商业数据库，基因或蛋白质的信息已成为各大药物公司追求的目标。

而CE-ECL仪器和分析技术将迎合这种发展趋势，成为推动生命科学发展的力量，带来巨大的社会和经济利益。

可以预言, 随着CE-ECL 技术的不断发展, 它将在复杂物质分离检测中拥有愈来愈广阔的应用前景。

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