(优质医学)信号通路研究的技术方法

Loop-12(T-Loop) sequence of MAP kinases
MAPK
Dural Phosphorylation Sites L-12 Length
**
hp38 DFGLARHTDD-------------EMTGYVATRWYRAPE 25
hP38 DFGLARQADE-------------EMTGYVATRWYRAPE 25
PRAK in vitro
MAPKAPK2
PRAK
MIX
Chromatograph y Chromatograph y Chromatograph y
+
Electrophoresis pH1.9
+
Electrophoresis pH1.9
+
Electrophoresis pH1.9
11
T182 is the regulatory phosphorylation site of PRAK
信号通路研究的技术方法
1
一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定
二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定 三、DNA重组技术的应用 四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用 五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用 六、细胞信号分子的荧光标记 七、细胞信号分子的三维结构分析 八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究 九、报告基因技术 十、蛋白质与核酸相互作用技术
kDa 97.468.043.9-
29.0-
18.4-
14.3-
-80kDa -47kDa -39kDa
-80kDa -47kDa
9
P38 MAP Kinase Pathway
10
二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定
Phosphopeptide map of HSP27 hosphorylated by
十一、对细胞内信号分子的干预技术 十二、信号分子基因表达检测技术
2
一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定
蛋白激酶磷酸化的检测
裂解培养的细胞获得裂解上清 以免疫共沉淀法获得蛋白激酶 SDS-PAGE 再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体 以Phospho Ab-HRP Western 化学发光检
活性诱变体 无活性诱变体 结构与功能的研究
PCR primer
PCR primer
13
14
The relationship between the members of MAPK family
JNK2 JNK3 JNK1 p38 p38 p38 p38 ERK1 ERK2 ERK5
15
Effect of individual MAPK pathways on PRAK activity in intact cells
HSP27 PRAK GST-ATF2 GST-ELK1
8
The major kinases of p38 and p38
A
B
Control Aniso. Arsenite TNF Control Aniso . Arsenit e TNF
YFUS3 DFGLARIIDESAADNSEPTGQQSGMTEYVATRWYRAPE 38
domain VII
VIII
16
Construction of p38 loop-12 to ERK like structure
6
Dynamic processes of p38 activation by LPS in RAW cells
Relative kinase activity
14
12
10
8
6
4
2
0 0 5 10 20 30 60 90 120
Time (min)
7
Control MKK1(E) MKK7(D)
hp38 DFGLARQADS-------------EMTGYVVTRWYRAPE 25
hp38 DFGLARHADA-------------EMTGYVVTRWYRAPE 25
hJNK1 DFGLARTAGTS-----------FMMTPYVVTRYYRAPE 27
hJNK2 DFGLARTACTN-----------FMMTPYVVTRYYRAPE 27
测试剂盒测定蛋白激酶的磷酸化程度。
3
经典蛋白激酶活性分析实验流程
以免疫共沉淀法获得蛋白激酶 加入该激酶底物和32-ATP，激酶使底
物磷酸化 放射自显影，确定磷酸化条带
4
非放射性蛋白激酶活性分析实验流程
以免疫共沉淀法获得蛋白激酶 加入该激酶底物，激酶使底物磷酸化 再加入底物磷酸化特异性抗体 以Phospho Ab-HRP Western 化学发光
检测试剂盒测定底物的磷酸化程度，进 而推出蛋白激酶活性

较传统激酶活性测定方法的优点
无需接触放射性物质 敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子 特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点
特异性分析 信噪比高 低背景 系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测
试酶活的试剂 节约时间：由几天降到几分钟
YHOG1 DFGLARIQDP-------------QMTGYVSTRWYRAPE 25
YSMK1 DFGLARGIHAGFFKCHS--TVQPHITNYVATRWYRAPE 36
YMPK1 DFGLARGYSENPVEN------SQFLTEYVATRWYRAPE 32
YKSS1 DFGLARCLASSSDSRET---LVGFMTEYVATRWYRAPE 35
A
p38-PRAK(182A)
B
+
p38-PRAK(182D)
+
p38-PRAK(wt)
+
Electrophoresis pH 8.9
Fold of Activation
+- +-+ - + - + - +- + - + -
20 15 10 5 0
p38 HSP27
12
三、DNA重组技术的应用
hJNK3 DFGLARTAGTS-----------FMMTPYVVTRYYRAPE 27
hERK1 DFGLARIADPEHDH-------TGFLTEYVATRWYRAPE 31
hERK2 DFGLARVADPDHDH-------TGFLTEYVATRWYRAPE 31
hBMK1 DFGMARGLCTSPAEH------QYFMTEYVATRWYRAPE 32