土壤微生物生物量的测定(滴定法)

1. 土壤微生物生物量的测定(滴定法)

一、实验目的和内容

土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（A TP）法。

氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。

二、实验材料和用具

仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）试剂：

1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。方法

为：量取500ml氯仿于1000ml分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，

充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约

20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。

2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于

300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。最后定容至1L；

3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾

（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；

4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有

0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；

5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，

化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，

搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。此溶液不稳定，需标定其浓度。

6.硫酸亚铁溶液浓度的标定：吸取重铬酸钾标准溶液（试剂3）10.00ml放入100ml

三角瓶中，加水约20ml，加浓硫酸3～5ml和邻啡罗啉指示剂2～3滴，用FeSO4

溶液滴定，根据FeSO4溶液的消耗量即可计算FeSO4溶液的准确浓度。

三、操作步骤

1．采样与样品预处理

土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物（如蚯蚓）等，然后尽快过筛（2～3mm），或放在低温下（2～4℃）保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到40％左右的田间持水量，在室温下放在密闭的装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个适中的烧杯，分别加入水和稀NaOH 溶液，以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最后立即分析，也可放在低温下（2～4℃）保存。

2．熏蒸

准确称取相当于25.0g烘干土重的湿润土壤3份，分别放在约100ml的玻璃瓶中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置几张用水湿润的滤纸，用少量真空胶密封干燥器，在专用三角瓶里装入约50ml无乙醇氯仿，把干燥器，装有无乙醇氯仿的三角瓶和真空泵装置连接好，使三通管连通干燥器和真空泵而不连通接氯仿瓶的阀门，打开电源开关，抽气至真空后，使三连通管连通上已装有约50ml无水乙醇氯仿的三角瓶，时间持续约2～3秒，至氯仿沸腾，立即关闭接抽气机的三通管（注意！），接着关闭真空泵电源。使氯仿不能回流到真空泵而损坏真空泵。然后在装氯仿的三角瓶下面接一盆热水（70℃），直到有氯仿液滴滴入干燥器，证明氯仿饱和，关闭干燥器的阀门，打开放气阀，氯仿倒回瓶中可重复使用。然后从真空表处拔出连接干燥器的软管，干燥器连同软管在25℃的黑暗条件下放置24～48h。小心打开阀门，如果没有空气流动的声音，表示干燥器漏气，应重新称样进行熏蒸处理。当干燥器不漏气时，在通风处打开，取出土样，让氯仿挥发约30min，擦尽干燥器底部，直到土壤闻不到氯仿气味为止。同时称同样量的土壤3份（也可在浸提前再称样），不进行熏蒸处理，作为对照。

3．浸提

熏蒸结束后，熏蒸处理过的土壤样品和未进行熏蒸处理的对照土壤样品转移到250ml 塑料瓶中，加入100ml硫酸钾溶液（试剂2）（硫酸钾溶液：土重＝4：1），在振荡机上振荡浸提30min（25℃），用定量滤纸过滤。同时做不加土壤的空白对照。

4．微生物生物量碳的测定（滴定法）

准确吸取浸提液5.0ml放入消煮管中，加入重铬酸钾标准溶液（试剂3）2.00ml，浓硫酸5ml，摇动试管，充分混匀，在试管上放一小漏斗，以冷凝蒸出的水气。将试管放入温度为175℃左右的石蜡油浴锅，注意调节使油浴锅温度维持在170－180℃，从试管内容物开始沸腾（有较大气泡）算起，准确煮沸10min，取出试管，稍冷却，拭净试管外部油滴。

将试管内容物倾入150ml三角瓶中，用蒸馏水少量多次洗净试管和漏斗，溶液亦并入三角瓶中。加水稀释至60－70ml，维持溶液酸度2－3mol（1/2H2SO4）L-1，加入2－3滴邻啡罗啉亚铁指示剂，然后用标准硫酸盐铁溶液滴定，溶液由橙色经过绿色，最后突变为砖红色，即为终点。

四、结果计算

（一）微生物生物量碳的计算

1．有机碳（Oc）的计算

ω(C)＝(V0-V1) ×c×3×ts×1000/m

式中：ω(C)——有机碳（Oc）质量分数，mg·kg-1；

V0——滴定空白样时所消耗的FeSO4体积，ml；

V1——滴定样品时所消耗的FeSO4体积，ml；

c——FeSO4溶液的浓度，mol·L-1

3——碳（1/4C）的毫摩尔质量，M（1/4C）=3mg/mmol；

ts——稀释倍数；100ml/5ml＝20

m——为烘干土质量，g。

2．微生物生物量碳的计算

ω(C)=Ec/K Ec

式中：ω(C)——微生物生物量碳（Bc）质量分数，mg·kg-1；

Ec——熏蒸土样有机碳与未熏蒸土样有机碳之差，mg·kg-1；

K Ec——氯仿熏蒸杀死的微生物体中的碳（C）被今天出来的比例，一般取0.38（Ocio and Brookes,1990）。